磷酸化蛋白质组学方法在信号网络解析中的应用

信号转导是细胞对各种外界刺激的应答反应,蛋白磷酸化或去磷酸化是信号从胞外流向胞内并导致细胞效应过程中的关键机制。磷酸化蛋白质组学(phosphoproteomics)是采用蛋白质组学的分析方法,研究细胞中所有磷酸化蛋白质及其修饰过程,从整体上观察细胞中被修饰的磷酸化蛋白质的状态及其变化,进而分析特定磷酸化修饰对生命过程的调控作用及其分子机制。     

亚细胞蛋白质组学研究

在蛋白质组学研究中首先要应用各种分离技术如双向电泳等将蛋白分离纯化,然后结合质谱技术、生物信息学方法对蛋白质进行鉴定。但细胞内的蛋白质种类繁多,性质多样．丰度差异大,常规蛋白质组学方法不能做到分离和检测细胞中的全部蛋白质。亚细胞蛋白质组学研究的着眼点在蛋白质组的特定成分,而非整个蛋白质组,能够有效弥补目前蛋白质组     

癌基因与化学致癌研究

自Miller等对化学致癌进行深入研究以来,多数人认为:致癌物经代谢活化为终致癌物、作用于靶细胞,形成致癌剂-DNA加合物,引起DNA损伤和生物特性改变,导致细胞突变和癌变;病毒学者们则强调病毒的致癌作用,提出了“前病毒”、“瘤基因”、“原生病毒”学说;二者之间未能取得共同可接受的观点。随后人们采用DNA重组、分子克隆和基因转移等技术,找到了长期以来臆测的致癌基因,从而有可能使二者殊途同归。如癌变分激发和促进二阶段,最初是由化学致癌研究者阐明的,近来亦被病毒学者尤为持癌基因观点的人们所接受。从此癌基因学说受到普遍重视,成为细胞癌变原理研究中十分活跃的理论。为此本文先扼要介绍癌基因的生物特性,再重点探讨化学致癌与癌基因的关系。     

应用激光捕获显微切割技术纯化的鼻咽癌蛋白质表达谱的建立

目的：建立鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)蛋白质表达谱,为NPC蛋白质组学研究奠定基础。方法：应用激光捕获显微切割（laser capture microdissection,LCM）技术从NPC组织纯化NPC细胞,应用二维凝胶电泳（2-DE）分离LCM 纯化NPC细胞的蛋白质,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定蛋白质,利用生物信息学资源构建NPC的2-DE蛋白质组数据库。 结果：建立了NPC蛋白质2-DE参考图谱,2-DE图谱共显示（1 312±30）个蛋白质点,共鉴定了427个蛋白质点,包括241个非冗余蛋白质,并构建了NPC的2-DE蛋白质组数据库,这些数据可从本实验室网站(http://www.xyproteomics.org)上进行查询。结论：首次建立了LCM纯化NPC细胞2-DE蛋白质表达谱,为NPC蛋白质组学研究提供了重要的信息和资料。     

鼻咽癌转移相关的分泌蛋白质的筛选

目的：筛选鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）转移相关的分泌蛋白质,为阐明NPC转移机制以及筛选NPC转移分子标志物提供实验依据。方法：应用二维凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）技术分离一对来自同一亲本,具有不同转移潜能的NPC细胞系5-8F和6-10B细胞的分泌蛋白质,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾-四极杆-串联质谱(ESI-Q-TOF MS/MS)对差异表达的蛋白质点进行鉴定。Western印迹法检测差异分泌蛋白质nm23-H1在两株细胞中的表达水平。结果：建立了5-8F和6-10B分泌蛋白质的2-DE图谱,质谱分析鉴定出14个非冗余的分泌蛋白质,其中Oncoprotein18等蛋白质在高转移潜能NPC细胞系5-8F中的表达水平高于无转移潜能的NPC细胞系,而nm23-H1等蛋白质在5-8F细胞系中的表达水平低于6-10B细胞系。Western印迹分析证实了nm23-H1在5-8F和6-10B细胞分泌蛋白质中的差异表达水平。结论：所鉴定的14个非冗余的差异分泌蛋白质为研究NPC转移机制以及筛选NPC转移分子标志物提供了实验依据。     

鼻咽癌成纤维细胞分泌性蛋白质的变化分析

目的 建立细胞分泌性蛋白质组学研究方法,分析鼻咽癌形成过程中成纤维细胞分泌蛋白的变化特征.方法 分别收集5份鼻咽癌和正常鼻咽组织标本,无血清培养成纤维细胞,收集细胞上清液,超滤法脱盐并浓缩上清液中分泌性蛋白,运用双向凝胶电泳(2-DE)技术建立分泌性蛋白表达图谱;并用比较蛋白质组学方法分析2组成纤维细胞分泌蛋白的差异,基质辅助激光解析飞行时间质谱分析鉴定差异蛋白;ELISA分析2组细胞上清液中半乳糖凝集素1的表达.结果 用自建细胞分泌性蛋白2-DE图谱,从2组细胞上清液中筛查出表达差异大于2倍的蛋白质点18个,质谱分析鉴定出11个分泌性蛋白;其中半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、补体组分Cls前体、不均一性核糖核蛋白Al在鼻咽癌间质成纤维细胞(CAFs)上清液中表达下调,而其余8个包括半乳糖凝集素1、14-3-3sigma蛋白、组织蛋白酶L等分泌性蛋白在CAFs上清液中表达上调;2组细胞上清液中半乳糖凝集索1分别为(4.95±0.76)ng/ml、(9.90±0.36)ng//ml(CAFs组),二者差异有统计学意义(P＜0.05).结论 鼻咽癌形成过程中成纤维细胞分泌性蛋白的变化涉及细胞信号转导、蛋白合成与降解等途径,CAFs可能通过上述途径调控肿瘤微环境,影响鼻咽癌的发生、发展、侵袭转移;这为今后分泌组学研究奠定了实验基础.     

放疗诱导鼻咽癌细胞株CNE1热休克蛋白高表达

目的鼻咽癌是一种以放射治疗为主的头颈肿瘤,但部分鼻咽癌对放疗耐受。为了解鼻咽癌放疗耐受机制,本实验拟初步探讨人高分化鼻咽癌细胞株CNE1放疗后的蛋白质改变。方法利用固相pH梯度二维凝胶电泳,建立CNE1放疗前后总蛋白质2DE图谱,利用MALDI TOF MS及数据库搜索初步分析和鉴定部分放疗前后差异蛋白质点。结果高分子量酸性蛋白质在CNE1放疗后20min高表达,其中大多为热休克蛋白质HSPs(heatshockproteins,HSPs)。结论放射能诱导CNE1的热休克蛋白高表达,它们可能与鼻咽癌放疗耐受有关。     

Comparative Proteome Analysis of Human Lung Squamous Carcinoma Tissue

目的利用蛋白质组学方法建立人肺鳞癌组织及其癌旁正常支气管上皮组织的差异蛋白质表达谱。方法对20例人肺鳞癌组织和配对的癌旁正常支气管上皮组织进行比较蛋白质组学研究,即利用双向凝胶电泳(2-DE)分离二者总蛋白质后,经图像分析识别差异表达的蛋白,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质。结果(1)比较分析20例肺鳞癌及正常配对组织的2-DE图谱,找到差异蛋白质点76个;(2)对68个差异蛋白质点进行了肽质指纹图分析,鉴定出一些与瘤基因、细胞周期调控、信号转导等有关的肺鳞癌相关蛋白;(3)肺鳞癌相关蛋白mdm2、c-jun和EGFR存人肺鳞癌组织中高表达,而在正常对照中均表达下调,与蛋白质组的分析鉴定结果是一致的。结论成功鉴定了68个肺鳞癌相关蛋白,为进一步筛选用于肺鳞癌诊断、治疗和预后评估的肺鳞癌分子标志物奠定了坚实的基础。     

双向电泳和质谱技术分析HCV NS3转化肝细胞的蛋白质组

目的:持续感染丙型肝炎病毒(HCV)在肝细胞癌(HCC)发生中起重要作用,细胞转染和成瘤实验表明HCV NS3对人肝细胞具有转化作用和致瘤活性.本实验旨在探讨HCV非结构蛋白3(NS3)转化肝细胞的蛋白质组.方法:构建稳定表达HCV NS3 N端多肽的人肝细胞(pRcHCNS3/QSG)及空白质粒转染细胞(pRcCMV/QSG),双向电泳技术分离两种细胞的总蛋白,差异蛋白质点进行质谱分析,Western印迹验证蛋白表达差异.结果:得到分辨率较高、重复性较好的双向电泳图谱.pRcHCNS3/QSG和pRcCMV/QSG细胞的蛋白质斑点数分别为(1 183±77)和(1 095±82)个,两组平均匹配数为(920±60)个.初步鉴定出15个有意义的蛋白质点.其中Ras,P38,HD53等参与调节信号转导的蛋白在pRcHCNS3/QSG细胞中表达上调,Western印迹结果亦证实pRcHCNS3/QSG细胞中磷酸化的P44/42和P38表达增加.鉴定出的差异蛋白质还包括一些调节细胞周期、免疫反应、与肿瘤侵袭和转移相关的蛋白质及参与肝脏代谢的蛋白质.结论:HCV NS3可能通过影响多种蛋白表达,经相应信号转导途径,如丝裂原活化蛋白激酶途径,使细胞发生恶性转化.进一步弄清信号转导过程和相互关系不仅对了解HCV相关性HCC的发生机制有重要意义,而且为从分子水平治疗HCC提供新思路.