大库容量人源性天然单链抗体库的构建

目的：构建一个大库容量（＞10^8）的人类天然单链抗体库。方法：从正常人400mL外周血分离林巴细胞,提取mRNA后反转录出cDNA第一链, 行半套式PCR扩增VH和VL基因片段,依次插入含Loxp和Loxp511序列的pDNA5,电转化TG1大肠杆菌,构建初级库进一步用初级库感染BS1365使其VH,VL发生重组从而获得次级库。结果：所有VH,VL亚类基因都得到了扩增,scFv克隆效率为99．9％,重组效率为每个单克隆BS1365中含至少8种不同的scFv基因。初级库容量为10^7,次级库容量至少为10^11。结论：我们采用细胞内重组的方法构建了10^11的人类天然抗体库。     

全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定

目的对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定,筛选肝癌抗体,同时对抗体的活性及特异性进行鉴定。方法PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率。先以人成纤维细胞吸附后再以体外培养的肝癌细胞SMMC7721为抗原对所建抗体库进行3轮“吸附洗脱扩增”的亲和筛选。将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定;通过ELISA法及FCM鉴定其与人肝癌细胞及正常细胞的结合活性。结果ScFv基因插入率为70%。在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第3轮为第1轮的214倍。筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定,均可检测到目的基因。ELISA分析结果显示18个克隆与SMMC7721呈阳性反应,阳性率为90%,15个克隆与成纤维细胞有交叉反应。得到3株肝癌单链抗体。ScFv的FCM鉴定表明,以正常胎肝细胞L02为对照,ScFv与肝癌结合比率为41.3%。特异性鉴定表明,其与肝癌细胞结合活性明显高于正常细胞。结论利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性。     

p53、Ras与VEGF在肝细胞肝癌中表达的关系

 目的　研究肝细胞肝癌中血管内皮生长因子 (VEGF ,vascularendothelialgrowthfactor)的表达与p5 3、Ras之间的关系。 方法　用免疫组化的方法研究了 4 5例肝癌标本VEGF、p5 3及Ras的表达。 结果　VEGF的表达率为 6 4.4 % (2 9/4 5 ) ,p5 3的表达率为 4 8.9% (2 2 /4 5 ) ,Ras表达率为 5 3.3% (2 4 /4 5 )。经连续切片对比分析表明 ,在VEGF表达较高的区域 ,p5 3、Ras的表达亦较强 ,但 χ2 检验仅发现 p5 3突变与VEGF表达相关 (χ2 =5 .6 5 ,P <0 .0 5 ) ,而未发现Ras与VEGF表达的相关性 (χ2 =0 .90 ,P >0 .0 5 )。结论　在肝细胞肝癌中 ,VEGF的表达与 p5 3的表达正相关 ,而与Ras不相关。     

肝血管瘤中VEGF的表达及其与AgNOR定量的关系

本文用肝血管瘤石蜡切片作血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）链霉亲和素—生物素—过氧化物酶免疫组织化学染色（即ＳＡＢＣ法）和核仁组成区相关嗜银蛋白（ＡｇＮＯＲ）计数方法，研究ＶＥＧＦ在肝血管瘤成因中的地位。结果显示:４８例肝血管瘤标本中，ＶＥＧＦ阳性表达率为７５．０％，其中（＋）者９例，（）者１１例，（）者１６例，且ＶＥＧＦ表达强度在不同的组别间ＡｇＮＯＲ计数差异显著（Ｐ＜０．０１）。提示ＶＥＧＦ在肝血管瘤的成因中可能具有重要意义。     

Construction and Significance of Directional Expression cDNA Library from Human NB4 Cells

Acutepromyeloidleukemia (APL)characterizedbythetranslocationt(15 ;17)isuniquelysensitivetothedifferentiation inducingeffectsofall trans retinoicacid (ATRA) .ATRAinducescompleteclinicalre missionsinmostofthepatientswithAPL .However ,chronicdailyoraladminis…     

提高柱式胶回收试剂盒DNA回收效率的最佳条件

目的　确定提高柱式胶回收试剂盒 DNA回收效率的最佳条件 .方法　回收的基本步骤遵循试剂盒附带的厂家说明 ,在此基础上 ,改变其中所用试剂的剂量 ,或者添加原试剂盒中没有的试剂 ,并在不同条件组合下分别进行 DNA回收 .电泳后 ,通过比较条带的亮度来比较不同条件下 DNA回收效率的大小 ,逐步确定最佳的胶回收条件 .结果　提高柱式胶回收试剂盒 DNA回收效率的最佳条件为 :切胶要尽量的小 ;每 l g胶用 6 0 0 μL的 S1;溶胶时间 :5 5℃ ,10 min;沉淀时加入 3/ 5总体积的异丙醇和 1/ 10总体积的乙酸钠 (3mol· L- 1 ,p H5 .2 ) ;沉淀时间 2 0 m in;沉淀温度为 2 5℃ (室温 ) ;用 T1液溶解效率高于用水溶 ;溶解时间为 2 0 m in (5 5℃ ) .这些最佳条件中 ,大部分都对原来的条件进行了改良 .结论　应用了改良后的胶回收条件后 ,胶回收的效率提高到原来的3～ 4倍     

乳腺癌抗hEGF单链抗体的筛选和活性鉴定

目的:从噬菌体单链抗体库筛选特异性的抗人表皮生长因子(hEGF)抗体并进行活性鉴定。方法:以hEGF为抗原,对所建抗体库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"的亲和筛选。将筛选后的单链抗体(scFv)通过ELISA和基因测序分析等方法进行鉴定;利用MTT法在体外培养的人乳腺癌细胞系MCF-7/Her-2+中检测抗体的生物结合活性。结果:在亲和筛选过程中,乳腺癌噬菌体scFv得到富集,收获率逐轮得到提高,3轮筛选之后,得到了3株高亲和力的抗hEGF抗体;ELISA检测筛选出的3种有较高活性;测序结果与人hEGF抗体基因序列高度一致;该抗体对MCF-7/Her2+乳腺癌细胞系有特异性杀伤作用。结论:成功地筛选到特异性抗hEGF的scFv抗体,为今后的研究和应用提供依据。     

肝细胞肝癌中p53、ras基因与血管内皮生长因子表达的关系

目的 研究肝细胞肝癌中血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）的表达与ｐ５３,ｒａｓ基因之间的关系。方法 用免疫组织化学方法研究４５例肝癌标本ＶＥＧＦ,ｐ５３及ｒａｓ基因的表达。结果 ＶＥＧＦ的表达率为６４．４％（２９／４５）,ｐ５３的表达率为４８．９％（２２／４５）,ｒａｓ表达率为５３．３％（２４／４５）,经连续切片对比分析表明,在ＶＥＧＦ表达较高的区域,ｐ５３,ｒａｓ的表达亦较强,但Ｘ＾２检验仅提示ｐ５３     

大容量人乳腺癌单链抗体库的构建与初步鉴定

目的利用细胞内重组技术构建大容量人乳腺癌单链抗体(scFv)库。方法收集30例乳腺癌外周转移淋巴结,依次提取总RNA、mRNA,RT-PCR扩增全套可变区基因(VL、VH),各自克隆到T载体,构建T载体库。然后从T载体上酶切VL、VH分步克隆到噬粒载体pDAN5,经电转化TG1得到初级库。辅助性噬菌体感染初级库,使噬菌体抗体表面呈现。提纯噬菌体抗体,滴定浓度后感染大肠杆菌BS1365进行细胞内重组。噬菌体挽救后再次提纯滴定噬菌体,感染大肠杆菌DH5αF',得到次级库,并测序验证。结果VH、VLT载体库分别为3.5×108和1.7×108,初级库库容量2.5×109。次级库库容量为2.5×1011。结论所采用的引物能够高效扩增目的片段,T载体的应用能够提高抗体基因的克隆效率,细胞内重组将进一步扩大库容量及增加其多样性,这种基于RT-PCR、T载体过渡、细胞内重组的路线能够构建大容量抗体库。