Fas/FasL基因转染联合顺铂对直肠癌细胞杀伤作用的研究

目的探讨Fas/FasL基因转染联合顺铂对直肠癌细胞的杀伤作用。方法构建pcDNA3.1-Fas/FasL真核表达载体,将人Fas/FasL基因通过脂质体导入直肠癌8348细胞中,并利用RT-PCR方法检测直肠癌8348细胞的Fas/FasL基因mRNA表达。用MTT法分析顺铂对转染前后的8348细胞抑制增殖和诱导凋亡的能力。结果Fas/FasL基因转染可明显增强直肠癌8348细胞的Fas/FasL表达。分别加入不同浓度顺铂(1、5、10、20、40μg/ml),Fas转染组8348细胞抑制率分别为47.2%、51.8%、57.2%、65.4%、71.0%;后者细胞抑制率分别为29.6%、33.0%、37.8%、41.4%、47.0%,其差异有显著性意义(t=15.33,P<0.01);FasL转染组8348细胞抑制率分别为11.0%、25.4%、31.2%、37.8%、42.4%;对照组8348细胞抑制率分别为26.1%、34.4%、37.6%、42.9%、53.2%,其差异有显著性意义(t=4.43,P<0.05)。结论转染的Fas/FasL基因可显著上调直肠癌8348细胞的Fas/FasL表达;Fas基因转染联合顺铂对直肠癌细胞有更强的杀伤作用;FasL基因转染可减弱顺铂对8348细胞的细胞毒作用,因此为直肠癌的基因治疗和化疗提供了理论依据。     

Fas基因转染联合顺铂对直肠癌细胞杀伤作用的研究

目的探讨Fas基因转染联合顺铂对直肠癌细胞的杀伤作用。方法采用RT PCR技术从健康人的外周血单核细胞中扩增包含全部阅读框架的Fas全长基因 ,与 pGEM TEasy质粒连接 ,经测序验证。构建 pcDNA3 1 Fas真核表达载体 ,将人Fas基因通过脂质体导入直肠癌 8348细胞中 ,并利用RT PCR方法检测直肠癌 8348细胞的Fas基因mRNA表达。用MTT法分析顺铂对转染前后直肠癌细胞抑制增殖和诱导凋亡的作用。结果Fas基因转染可明显增强直肠癌 8348细胞的Fas表达 ,分别用 1、5、10、2 0、4 0mg/L浓度的顺铂作用 ,转染Fas基因的 8348细胞实验组细胞抑制率分别为 4 7 2 %、5 1 8%、5 7 2 %、6 5 4 %、71 0 % ;未转染Fas基因的 8348细胞对照组细胞抑制率分别为 2 9 6 %、33 0 %、37 8%、4 1 4 %、4 7 0 % ,2组相比 ,差异有显著性意义 (t =15 33,P <0 0 1)。结论转染的Fas基因可显著上调直肠癌 8348细胞的Fas表达 ,促进细胞凋亡 ,Fas基因转染联合顺铂对直肠癌细胞有更强的杀伤作用。     

FasL cDNA转染对直肠癌细胞顺铂耐药性的影响

目的:探讨FasLcDNA转染和表达对直肠癌细胞耐药性的影响。方法:用RT-PCR方法克隆人FasL全长cDNA,构建pcDNA3.1-FasL真核表达载体,用脂质体法转染HR-8348人直肠癌细胞,采用MTT法检测顺铂对转染和未转染直肠癌细胞的生长抑制率。结果:DNA测序证实克隆FasLcDNA898bp与GeneBank序列完全一致。构建真核表达载体转染HR-8348细胞后,FasLmRNA表达明显增强。在不同浓度顺铂(1、5、10、20、40mg/L)的作用下,FasL转染组直肠癌细胞抑制率分别为11.0%、25.4%、31.2%、37.8%、42.4%:对照组癌细胞抑制率分别为26.1%、34.4%、37.6%、42.9%、53.2%,其差异有显著性意义(t=4.43,P<0.05)。结论:FasL转染HR-8348细胞可增强癌细胞的耐药性,减弱顺铂对HR-8348细胞的杀伤作用。     

FasL相互作用蛋白的筛选及其在大肠癌研究中的意义

目的建立FasL相互作用蛋白的酵母双杂交系统，筛选与FasL相互作用的蛋白质，探讨FasL及其相互作用蛋白在大肠癌发生与发展中的意义，为筛选大肠癌早期诊断标志物和治疗靶标提供理论依据。方法以FasL作为诱饵蛋白，在人胎肝cDNA文库中筛选与FasL相互作用的蛋白质；将FasL相互作用蛋白的基因转染人直肠癌HR-8348细胞，通过细胞学实验（四唑蓝比色法），研究FasL及相互作用蛋白对直肠癌细胞耐药性的影响；应用免疫组织化学方法检测FasL及相互作用蛋白在大肠癌标本中表达情况，比较在大肠癌不同分期中这些蛋白的表达差异，研究他们在大肠癌发生与发展中的作用机制。结果筛选出10个与FasL特异性相互作用的蛋白，包括金属硫蛋白1K、1G、2A，组织蛋白酶B，脂肪酸合成酶，干扰素d诱导蛋白27，磷脂清除酶，丝氨酸／苏氨酸样激酶，锚着黏附蛋白以及纤维微丝蛋白一5等。细胞耐药实验证实，FasL与金属硫蛋白和组织蛋白酶之间的相互作用能够增强人直肠癌HR-8348细胞的耐药能力。免疫组织化学结果表明，癌变的大肠癌组织中FasL、组织蛋白酶、金属硫蛋白表达明显增高，高于正常大肠黏膜（P〈O．05）。结论FasL与组织蛋白酶、金属硫蛋白、锚着黏附蛋白等之间的相互作用与大肠癌的侵袭力及癌细胞产生耐药性密切相关：FasL、组织蛋白酶、金属硫蛋白可能为大肠癌诊断的标志物；FasL及其相互作用蛋白可作为治疗大肠癌新的分子标靶。     

结直肠癌肝转移蛋白质组表达差异及其意义的研究

目的利用蛋白质组研究技术分离、鉴定结直肠癌肝转移相关蛋白,探讨结直肠癌肝转移分子机制。方法用等电聚焦/SDS聚丙烯酰胺双向凝胶电泳对比分析结直肠癌原发灶、癌旁肠黏膜和肝转移灶中蛋白质组表达差异,经MALDI-TOF-MS质谱分析、鉴定差异蛋白点,采用Western杂交检测结直肠癌肝转移相关蛋白表达。结果经双向电泳图像对比分析,癌旁肠黏膜组织中蛋白质斑点为(390±28)个,结直肠癌原发灶和肝转移灶中蛋白质斑点分别为(206±22)个和(236±19)个。结直肠癌肝转移灶中蛋白质表达与癌原发灶、癌旁肠黏膜相比差异有显著性意义(t=17.321、t=29.637,P<0.01)。对肝转移灶中一个特异蛋白质点行质谱检测,经Profound检索同源分析,确定该蛋白点相对分子质量为21.25×103,等电点为6.8,与细胞周期蛋白42(Cdc42)同源。Western杂交检测25例结直肠癌标本,癌旁肠黏膜中Cdc42表达检测为阴性。在癌原发灶中Cdc42表达阳性率为16%(4/25)。肝转移灶中检测Cdc42表达阳性率为100%(25/25)。结论结直肠癌肝转移蛋白质组表达差异研究有助于鉴定在肝转移中起重要作用的蛋白质,Cdc42作为结直肠癌肝转移相关蛋白,对癌细胞生物学行为改变有重要影响,可促进肝转移的发生。     

CD/5-FC对人直肠癌细胞辐射增敏作用的研究

尽管基因治疗肿瘤的基础和临床研究已取得很大成绩 ,但治疗效果仍不理想。我们观察了胞嘧啶脱氨酶基因 (ｃｙｔｏ ｓｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅＣＤ)和 5 氟胞嘧啶 (5 ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ 5 ＦＣ)联合放射线对人直肠癌ＨＲ 8348细胞的杀伤作用 ,观察了ＣＤ/ 5 ＦＣ治疗的辐射增敏作用 ,探讨提高ＣＤ/ 5 ＦＣ治疗直肠癌的疗效的方法。材料和方法1.主要试剂和仪器 :ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＲｅａｇｅｎｔ(ＧＩＢＩＣＯＬ)、16 4 0培养基 (ＧＩＢＩＣＯＬ)、胎牛血清 (ＧＩＢＩＣＯＬ)、60 Ｃｏ源 (军事医学科学院放射所 )、ＨＲ 8348…     

蛋白质分步提取法的建立及在大肠癌蛋白质组研究中的应用

利用等电聚焦/聚丙烯酰胺双向凝胶电泳(2-DE)对蛋白质进行分离是蛋白质研究的核心技术之一。目前常用的蛋白样品制备和提取方法存在一定缺陷,直接影响蛋白质组的分析结果。我们在大肠癌发生、发展的蛋白质组研究中,采用分步提取法,以3种分别适于溶解高、中、低、亲水性蛋白质的裂解液提取正常结直肠黏膜组织和癌组织中的蛋白质组成分,进行双向电泳,提高了蛋白质提取率和2-DE分辨率,现报道如下。 一、材料与方法     

人FasL全长cDNA的克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆人FasL全长cDNA并构建其真核表达载体。方法：采用RT-PCR法从健康人外周血单核细胞中扩增包含全部阅读框架的FasI。全长cDNA，将之与pGEM-T：Easy质粒连接、测序。构建pcDNA3．1-FasL真核表达载体，用脂质体介导方法转染人直肠癌8348细胞，检测FasL表达情况。结果：RT-PCR扩增的FasL产物经限制性内切酶酶切后生成的片段符合预期大小。克隆测序证实所得的FasL cDNA序列与Gene Bank序列完全一致。pcDNA3．1-FasL重组质粒经：EcoRI XhoI双酶切后，电泳显示898bp目的片段和pcDNA3．1载体片段，证明重组质粒正确。转染直肠癌8348细胞后。用RT-PCR方法检测FasL表达阳性。结论：采用RT-PCR方法成功克隆了人FasL全长cDNA并构建了其真核表达载体．为进一步研究FasL功能奠定了基础。     

顺铂联合胞嘧啶脱氨酶自杀基因对直肠癌细胞杀伤作用的研究

目的探讨顺铂联合胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因对直肠腺癌细胞8348的杀伤作用。方法以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,观察在顺铂作用下GFP基因对8348细胞的转染效率;用克隆形成试验观察顺铂对CD基因转染效率的影响;同时用四甲基偶氮唑盐(MTT)试验检测顺铂联合CD/5-氟胞嘧啶(5-FC)对8348细胞的杀伤作用。结果顺铂提高质粒对8348细胞的转染效率26倍。对腺癌细胞的杀伤效率:单纯转染CD基因组为14.9%;IC50的氟尿嘧啶(5-FU)联合CD基因组为54.9%;IC50的顺铂联合CD基因组为88.5%,与其他两组相比,对癌细胞杀伤效率明显增强(P<0.01)。结论顺铂联合CD自杀基因能更有效地杀伤直肠腺癌细胞,可成为治疗直肠癌术后复发及转移的一种有效的方法。