斑马鱼：肾脏发育与疾病研究的理想模式生物

斑马鱼（zebrafish）为小型热带鱼类，具有世代周期短（2～3个月）、产卵量大、形体较小（成体仅长3～4cm）的特点，尤其是卵子体外受精，胚胎发育速度快，仅需2．5d就可发育为幼鱼。此外，斑马鱼的精子还可通过冷冻来保存，而且胚体完全透明，胚胎发育过程可以直接观察使得发育异常的突变体很容易被识别，这就给遗传操作和人工诱变提供了极为有利的条件。     

podocin基因敲低对小鼠足细胞nephrin和α-actinin表达与分布的影响

目的 研究足细胞分子podocin、nephrin和α-actinin之间的相互作用和联系。方法 将针对podocin分子设计的特异RNA干扰(RNAi)质粒导人体外培养的小鼠足细胞系(MPC5)；应用免疫荧光染色及双标记在共聚焦显微镜下观察nephrin、podocin和α-actinin的分布方式；半定量RT-PCR和免疫蛋白印迹检测podocin、nephrin，α-actinin-4及内参照GAPDH／β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表达量。结果 (1)干扰组podocin的荧光强度显著低于对照组，其mRNA和蛋白的表达量分别下降了65％和89％。免疫双标记显示podocin的分布发生了明显变化：对照组podocin不但分布在胞核的周围，而且在胞浆呈放射性沿着细胞骨架分布，以及主要在胞膜上呈连续性的线状分布；干扰组podocin呈点状分布在胞核周围。(2)干扰组nephrin的荧光强度亦明显减低，其mRNA及蛋白的表达量分别减少了70％和78％。免疫双标记显示nephrin的分布也发生了显著变化：干扰组nephfin亦呈点状分布在胞核周围；在对照组，nephrin和podocin的分布方式相同。(3)干扰组和对照组α-actinin的分布及在mRNA和蛋白水平上的表达量无明显差异，呈细丝状均匀分布于胞质内，亦呈放射性分布于足细胞伸出的突起中。结论 通过RNAi成功地使MPC5的podocin表达下调。Podocin和nephrin分子关系紧密，可能存在着直接的分子间反应；podocin与α-actinin无直接的作用和联系。     

通过基因敲低探讨多个足细胞分子作用及分子间反应

目的 研究足细胞裂孔隔膜(SD)复合体分子nephrin､podocin和CD2AP,以及足细胞骨架蛋白α-辅肌动蛋白(actinin)-4的作用及分子间反应｡方法 针对nephrin､ podocin､CD2AP和α-actinin-4 mRNA序列分别设计并构建2个特异RNA干扰质粒-psiRNA-hH1GFPzeo,分别导入小鼠足细胞系MPC5以 “敲低”其表达｡免疫荧光染色观察其分布方式｡半定量RT-PCR和免疫蛋白印迹检测其mRNA和蛋白表达｡ 结果 (1) podocin敲低组(siPod966和siPod54):未检测到podocin及nephrin mRNA,其蛋白分别下降了92%､79%及82%､67%｡而CD2AP mRNA和蛋白分别增加了62%､42%及71%､46%｡α-actinin-4无变化｡(2)nephrin敲低组(siNep492):未检测到nephrin mRNA和蛋白｡而CD2AP mRNA和蛋白分别增加了35%､48%｡Podocin和α-actinin-4无变化｡(3)CD2AP敲低组(siCda744和siCda21):未检测到CD2AP mRNA,其蛋白分别下降了92%和83%｡Nephrin mRNA和蛋白分别下降了60%､48%及76%､72%;而podocin mRNA和蛋白分别增加了38%､22%及56%､44%｡Α-actinin-4无变化｡(4)α-actinin-4敲低组(siAct1790和siAct319):α-actinin-4和nephrin 的mRNA分别下降了69%､58%及64%､49%;蛋白分别下降了81%和55%以及71%､64%｡而podocin以及CD2AP mRNA分别增加了50%､34%及45%､28%;蛋白分别增加了64%､46%及65%､42%｡(5)敲低nephrin､podocin和CD2AP后,这些表达量降低的分子的分布发生了明显改变,即以核周为主;而相应分子敲低后引起的podocin和CD2AP表达增加,其分布亦主要以核周染色增强为主｡α-actinin-4即使表达降低,分布亦无变化,仍呈细丝状分布于胞质及足细胞伸出的突起中｡结论 (1)在SD复合体分子中,nephrin可能具有相对独立的作用｡(2) α-actinin-4对nephrin､podocin和CD2AP有直接或间接的作用｡(3)足细胞分子间的作用和联系不总是“一致的”,可能是“单向的”､也可能是“双向的”｡(4)nephrin､podocin､CD2AP和α-actinin-4在足细胞的分布有赖于其表达量的正常及正常的分子间反应｡     

Nephrin,podocin及α-actinin在小鼠肾小球足细胞系的表达与分布

目的 :探讨nephrin ,podocin及α actinin在小鼠肾小球足细胞系 (MPC5)的表达与分布 ,为进一步研究上述分子间的相互作用建立稳定的实验平台。　 方法 :培养小鼠MPC5,以γ 干扰素诱导在 33℃传代增生 ,继而在37℃培养两周使细胞分化成熟以用于实验研究。相差显微镜观察足细胞形态 ;免疫荧光染色观察nephrin ,podocin ,α actinin及WT1在足细胞的分布 ;RT PCR检测足细胞nephrin ,podocin及α actinin 4的mRNA ;免疫蛋白印迹检测nephrin ,podocin ,α actinin及WT1蛋白。　 结果 :成熟足细胞呈星形且有突起形成。免疫荧光及免疫蛋白印迹显示足细胞特异性的表达WT1分子。免疫荧光染色可见nephrin和podocin在足细胞内均呈线状分布于胞膜表面 ,α actinin呈细丝状分布于胞质内及伸出的突起中。在mRNA水平及蛋白水平均检测到nephrin ,podocin和α actinin 4表达 ,其蛋白大小分别为 180KDa,4 5KDa和 10 0KDa。　 结论 :首次在mRNA水平及蛋白水平证实了小鼠MPC5能够表达nephrin ,podocin及α actinin ,为进一步研究这些分子间的相互作用奠定了基础。     

足细胞分子高表达致阿霉素肾病大鼠发生蛋白尿

目的 动态观察足细胞裂孔隔膜复合体分子nephrin、podocin、CD2AP及α-actinin-4在阿霉素肾病大鼠蛋白尿发生发展中的表达变化，探讨其在蛋白尿发生发展中的分子行为及其机制。方法 尾静脉注射阿霉素建立阿霉素肾病大鼠模型，3、7、14、28 d每组处死6只大鼠留取肾脏标本。应用间接免疫荧光染色、实时定量PCR、Western 印迹分别检测各个时间点nephrin、podocin、CD2AP、α-actinin-4的分布、mRNA和蛋白表达量的变化。结果 (1)14 d肾病组大鼠24 h尿蛋白显著高于对照组(P < 0.01)，增高持续到28 d。(2)透射电镜显示14 d肾病组足突不同程度变宽，28 d足突弥漫性融合。(3)与对照组相比，从第7天开始肾病组nephrin和podocin染色从沿肾小球毛细血管袢线样分布向不连续粗颗粒样的分布模式转变；CD2AP节段染色增强区逐渐扩大，有的区域呈斑片状和连续线状增强；α-actinin-4从沿肾小球毛细血管袢均匀的点线样分布向不均匀粗颗粒的分布转变，而且随时间进展这种转变逐渐加重。(4)与对照组相比，肾病组于7 d时nephrin mRNA表达显著增高(P < 0.01)；podocin mRNA表达14 d时显著增高(P < 0.05)，直至28 d(P < 0.05)；CD2AP mRNA表达28 d时显著增高(P < 0.05)。(5)与对照组相比，肾病组nephrin蛋白表达28 d时显著增高(P < 0.05)；podocin蛋白表达于7 d时显著增高(P < 0.05)，而28 d时又显著降低(P < 0.05)；CD2AP蛋白表达于14 d时显著增高(P < 0.05)，直至28 d (P < 0.05)。(6)α-actinin-4 mRNA与蛋白表达在实验过程中未出现明显变化。结论 nephrin、podocin和CD2AP的表达增加及分布异常是导致阿霉素肾病大鼠蛋白尿发生发展的分子机制，而分子表达的增加是足细胞抵抗损伤的一种代偿反应。     

Nephrin，podocin及α-actinin在小鼠肾小足细胞系的表达与分布

目的：探讨nephrin，podocin及α-actinin在小鼠肾小球足细胞系(MPC5)的表达与分布，为进一步研究上述分子间的相互作用建立稳定的实验平台。方法：培养小鼠MPC5，以γ-干扰素诱导在33℃传代增生，继而在37℃培养两周使细胞分化成熟以用于实验研究。相差显微镜观察足细胞形态；免疫荧光染色观察nephrin，podocin，α-actinin及WTl在足细胞的分布；RT-PCR检测足细胞nephrin，podocin及α-actinin4的mRNA；免疫蛋白印迹检测nephrin，podocin，α-actinin及WTl蛋白。结果：成熟足细胞呈星形且有突起形成。免疫荧光及免疫蛋白印迹显示足细胞特异性的表达WTl分子。免疫荧光染色可见nephrin和podocin在足细胞内均呈线状分布于胞膜表面，α-actinin呈细丝状分布于胞质内及伸出的突起中。在mRNA水平及蛋白水平均检测到nephrin，podocin和α-actinin-4表达，其蛋白大小分别为180KDa，45KDa和100KDa。结论：首次在mRNA水平及蛋白水平证实了小鼠MPC5能够表达nephrin，podocin及α-actinin，为进一步研究这些分子间的相互作用奠定了基础。     

足细胞骨架蛋白相关分子网络在足细胞损伤和蛋白尿发生中的作用

足细胞,即肾小球脏层上皮细胞,具有复杂的细胞形态和结构,包括胞体以及从胞体依次伸出的主足突和次级足突(foot process)[1]".毗邻足细胞的足突之间形成的裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)构成肾小球滤过的最后一道屏障.近来SD组成分子如nepbrin、podocin和CD2AP以及离子通道蛋白TRPC6的发现进一步证实足细胞足突及其SD结构和功能异常是蛋白尿发生的重要原因[2].     

足细胞上血管紧张素受体的研究进展

血管紧张素受体(ATR)属于细胞膜受体的一种,是肾素-血管紧张素系统(RAS)中重要的作用靶点,主要通过与血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)结合而发挥效应.目前研究发现AngⅡ的受体有AT1R和AT2R两型.     

邻苯三酚红钼络合法与双缩脲比色法测定嘌呤霉素肾病大鼠尿中总蛋白浓度的比较

目的:探讨临床上新近推广的邻苯三酚红钼络合法与双缩脲比色法的相关性和偏倚,旨在评价其测定大鼠尿蛋白的可靠性,以建立一种快速、简便、可靠的大鼠尿蛋白测定方法。方法:收集15例正常对照大鼠以及35例不同时间点嘌呤霉素肾病大鼠24h尿液标本,采用双缩脲比色法和邻苯三酚红钼络合法进行尿总蛋白定量,结果分别采用Pearson相关、Passing-Bablok回归和Cusum方法检测回归偏倚,偏倚分析采用Bland-Altman法。结果:Pearson相关性分析结果显示,邻苯三酚红钼络合法测定值与双缩脲比色法测定值显著相关(r=0.9942,P<0.0001)。Passing-Bablok回归分析显示,邻苯三酚红钼络合法测定值与双缩脲比色法测定值的回归方程为Y=1.0922X-0.3771(Y表示双缩脲比色法,X表示邻苯三酚红钼络合法),线性回归的Cusum检验证实线性回归偏倚无统计学意义(P>0.05),Bland-Altman偏倚分析结果示,邻苯三酚红钼络合法与双缩脲比色法测定值的平均偏倚为-0.1。结论:邻苯三酚红钼络合法具有灵敏度高、重复性好、标本用量少、样品不需要预处理并适用于自动化分析的特点,推荐该法应用于尿...     

肾病综合征分子遗传学研究进展

肾病综合征（NS）是儿科常见的肾脏疾病,尽管临床上依据“三高一低”的症状及肾活检进行诊断,但由于发病机制不清楚,使我们不易作出其对激素治疗是否敏感的准确判断。随着分子遗传学的发展确定了一些NS相关新基因,为我们做到“基因诊断”、指导治疗奠定了基础。该文主要讨论先天性NS、常染色体隐性或显性家族性局灶节段性肾小球硬化（FSGS）、散发性NS以及综合征性弥漫性系膜硬化（DMS）或FSGS的分子遗传学进展