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1.
ERCC1的表达纯化及其单克隆抗体的制备 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:表达纯化ERCC1蛋白并制备其单克隆抗体(mAb).方法:克隆并原核表达ERCC1蛋白, 其氨基端带有6-His标签.纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠, 经融合、筛选制备特异性mAb.结果:成功表达了ERCC1蛋白.SDS-PAGE显示所表达蛋白的相对分子质量(Mr)约为37 000.获得了1 株稳定分泌抗ERCC1抗体的杂交瘤细胞株(6F8), 其分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG2b.ELISA检测, 对应腹水mAb的效价为1∶ 1.5×106.Western blot结果显示抗ERCC1 mAb具有良好的特异性.结论:成功地表达纯化ERCC1蛋白并制备了1株抗ERCC1 mAb. 相似文献
2.
目的利用昆虫细胞杆状病毒系统表达人的重组可溶性L-型选择蛋白配体凝集素(human recombinant soluble L-selectin:sL-selectin),探索在真核细胞中高效表达人的重组可溶性L-型选择蛋白配体凝集素的新途径。方法将已经重组好的杆状病毒感染昆虫细胞,表达sL-选凝素于细胞培养上清,利用末端连接的ZZ-结构域(蛋白A来源的首尾相连的二聚化Z结构域)与IgG-琼脂糖-6的结合而分离纯化,通过SDS-PAGE鉴定分子量的大小,并用特异性抗体验证,另外通过重组的sL-选凝素与SMMC7721的黏附观察其活性。结果sL-选凝素可在昆虫细胞中表达,产物的分子量约为46000,与人肝癌细胞SMMC7721的结合率可达70%。结论sL-选凝素可通过杆状病毒载体在昆虫细胞中有效表达,分离纯化后依然保持生理活性。 相似文献
3.
目的:探讨酪氨酸蛋白激酶受体EphA2在人脑胶质瘤中的表达及其与胶质瘤微血管生成之间的相关性。方法:用免疫组化方法检测66例人脑胶质瘤组织,2株成胶质细胞瘤细胞系(U251和U87)和10例正常脑组织中EphA2蛋白的表达情况。并用Western blot方法进一步验证高级别成胶质细胞瘤组织和正常脑组织中EphA2的表达情况。通过CD34免疫组化染色方法来计算胶质瘤组织中的微血管数(MVC),探讨EphA2的表达水平与胶质瘤的微血管生成之间可能存在的关系。结果:免疫组化结果表明:在所有检测的66例胶质瘤中,除3例低级别胶质瘤(Ⅰ~Ⅱ)未检测到EphA2表达外,其余均有不同程度的EphA2表达,阳性率为95.5%(63/66);而10例正常脑组织中EphA2蛋白表达均为阴性,二者差异显著(P〈0.01)。并且高级别脑胶质瘤(Ⅲ~Ⅳ)中EphA2强阳性表达率为63%(29/46),明显高于低级别胶质瘤30%(6/20)的阳性表达率,二者差异显著(P〈0.01)。此外,肿瘤组织内微血管内皮细胞也有EphA2蛋白表达。Westernblot结果也进一步证实了成胶质细胞瘤组织和细胞系U251高表达EphA2蛋白,且U87表达水平明显低于U251,正常脑组织中检测不到EphA2蛋白条带。胶质瘤的微血管密度与EphA2蛋白表达水平有显著相关性(r=0.713,P〈0.01),EphA2表达强阳性的肿瘤区域有较高的微血管密度。结论:EphA2特异地表达于高级别胶质瘤中,而正常脑组织中则检测不到EphA2表达,提示EphA2有可能是恶性胶质瘤的一个新的标志物,或可作为分子治疗的靶点,并且EphA2可能参与胶质瘤的血管生成,在胶质瘤的发病和恶性进展中起重要作用。 相似文献
4.
酪氨酸蛋白激酶受体EphA2及其配体EFNA1在23种肿瘤细胞系中的表达及其意义 总被引:4,自引:0,他引:4
背景与目的:酪氯酸蛋白激酶受体EphA2及其配体EFNA1可能在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。本研究探讨EphA2/EFNA1在不同肿瘤细胞中的表达及其意义。方法:用RT-PCR方法,检测了23种人类肿瘤细胞系中EphA2/EFNA1在mRNA水平上的表达,、并用Western blot方法检测了EphA2蛋白在不同肿瘤细胞系中的表达水平。结果:RT—PCR结果显示.除白血病细胞K562和HL60,以及视网膜母细胞瘤RB几乎检测不到EphA2/EFNA1外.EphA2/EFNA1高表达于肝癌、肺癌、卵巢癌、官颈癌、前列腺癌、胃腺癌、脑胶质瘤、膀胱癌、成骨肉瘤及恶性黑色素瘤等20种细胞系中。Western blot结果显示,除K562外,EphA2蛋白在不同肿瘤细胞系中均有表达。结论:EphA2/EFNA1高表达于人类多种肿瘤细胞中,并且EFNA1的表达水平相对低于EphA2的表达、EphA2./EFNA1可作为一个较为广潜的肿瘤标记,并有可能成为肿瘤治疗的靶点。 相似文献
5.
目的构建稳定表达表皮生长因子受体(EGFR)胞外区(EGFRex)的NIH3T3细胞株。方法构建带有EGFRex基因的重组真核表达质粒PLNCX2-EGFRex,经脂质体法转染NIH3T3细胞后,用G418筛选阳性克隆,用免疫组化和蛋白质印迹(Western blot)检测EGFRex蛋白的表达,用EGF-EGFP蛋白检测其活性。结果成功构建了真核表达载体PLNCX2-EGFRex。以其转染NIH3T3细胞后,经免疫组化和Western blot检测到EGFRex的表达。在荧光显微镜下见细胞膜上有绿色荧光。结论人EGFRex在NIH3T3细胞内以其天然活性形式稳定表达,为抗体制备奠定了基础。 相似文献
6.
稳定表达EGFRvⅢex的NIH3T3细胞株的建立及其免疫原性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:建立表皮生长因子突变体Ⅲ胞外区(EGFRvⅡ-Iex)的NIH3T3稳定细胞系并分析其免疫原性。方法:将编码EGFRvⅢex基因的表达质粒pLNCX2-EGFRvⅢex转染NIH3T3细胞后,用G418筛选阳性克隆,得到多个细胞克隆。采用免疫组化和Western blot法鉴定这些细胞克隆。选取高表达EG-FRvⅢex的细胞株(命名为3T3-vⅢex)免疫BALB/c小鼠,制备抗血清。用ELISA、Western blot和免疫荧光分别检测抗血清的效价和特异性。结果:成功地构建了真核表达载体pLNCX2-EGFRvⅢex并获得了稳定高表达EGFRvⅢex的NIH3T3细胞系3T3-vⅢex。用3T3-vⅢex免疫小鼠所获得的抗血清效价为10-5。Western blot和免疫荧光鉴定证明抗血清可以与EGFR-vⅢex特异结合。结论:人EGFRvⅢex可在NIH3T3细胞内获得稳定表达,以其免疫小鼠可以获得高效价、高特异性的抗血清。 相似文献
7.
目的: 制备靶向表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)隐蔽表位(287-302)的免疫毒素,并鉴定其生物学功能。 方法: 通过基因工程方法将抗EGFR(287-302)的806单链抗体(806 single-chain antibody fragment, 806scFv )基因经柔性肽与铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A, PEA)的截短形式PE38KDEL连接,构建原核表达载体pET-22b-806scFv-PE38KDEL并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经纯化获得该免疫毒素融合蛋白806scFv-PE38KDEL,ELISA和流式细胞术检测其与EGFR的结合活性,间接免疫荧光检测重组免疫毒素的内化作用,CCK-8法检测806scFv-PE38KDEL对人脑胶质瘤细胞U87MG和U87MG-EGFRvⅢ、表皮癌细胞A431、乳腺癌细胞MDA-MB-468、舌癌细胞CAL-27的细胞毒性。 结果: 成功构建重组免疫毒素806scFv-PE38KDEL,诱导表达的蛋白806scFv-PE38KDEL以包涵体形式存在,经纯化后的纯度>95%,经SDS-PAGE和Western blotting 鉴定为目的蛋白。806scFv-PE38KDEL 能EGFRvⅢ胞外段蛋白结合,还能与外源性表达EGFRvⅢ的肿瘤细胞和高表达EGFR的肿瘤细胞相结合,而与表达低水平EGFR的肿瘤细胞不结合。806scFv介导了重组免疫毒素的内化。806scFv-PE38KDEL对靶细胞有明显的杀伤作用,对过表达EGFRvⅢ的U87MG-EGFRvⅢ细胞IC50值为(5.85±0.03) ng/ml,对EGFR高表达细胞MDA-MB-468、A431、CAL-27的IC50值分别为(162.80±0.06)、(75.72±0.04)、(123.70±0.03) ng/ml。在1 μg/ml的质量浓度下,相比PBS对照组,806scFv-PE38KDEL对U87MG-EGFRvⅢ 、MDA-MB-468、A431和CAL-27细胞增殖的抑制率均显著增高\[(98.67±0.07)% vs (2.45±2.85)%、(86.26±101)% vs (0.48±1.76)%、(96.72±016)% vs (1.33±1.31)%、(96.29±0.30)% vs (2.00±0.60)%,均P<0.01\],而对U87MG细胞几乎没有抑制作用\[(359±2.09)% vs (0.19±0.95),P>0.05\]。 结论: 本研究所制备的靶向EGFR(287-302)表位的重组免疫毒素806scFv-PE38KDEL能特异地结合并杀伤EGFRvⅢ或EGFR高表达的肿瘤细胞。 相似文献
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导入野生型p53基因对T细胞淋巴瘤化疗敏感性的影响 总被引:1,自引:1,他引:0
目的:探讨野生型p53基因对T细胞淋巴瘤Jurkat细胞化疗敏感性的影响.方法:用脂质体介导法,将p53基因导入Jurkat细胞,经G418筛选获得p53稳定表达的细胞, 将细胞分别与0.1~100 μg/ mL 阿霉素(doxorubicin,ADM)或0.1~100 μg/mL足叶乙甙(etoposide, VP16) 培养24 h,采用MTT法检测细胞的生长抑制率.结果:转染p53基因的Jurkat细胞在0.47 μg/mL ADM和2.5 μg/mL VP16作用后,细胞生长抑制率为50%,与空载体转染组和未转染组比较,半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)明显降低(P<0.05).结论:p53基因能提高T细胞淋巴瘤Jurkat细胞对化疗药物ADM和VP16的敏感性, p53基因联合化疗药物可能成为耐药T细胞淋巴瘤治疗的新途径. 相似文献
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铁树叶提取液对白血病细胞株K562、HL—60增殖抑制作用的实验研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的观察铁树叶在白血病细胞株K562及HL-60中的作用.方法细胞培养液中分别加入铁树叶(实验组1和实验组2)及P.B.S(对照组1和对照组2),观察集落细胞数、死活细胞计数及细胞蛋白质含量.实验组和对照组比较,死活细胞计数和细胞蛋白含量P值均<0.05,集落细胞计数实验组抑制率50%.结果实验组和对照组比较,死活细胞计数和细胞蛋白含量P值均<0.05,集落细胞计数实验组抑制率>50%.结论铁树叶提取液对白血病细胞株K562及HL-60细胞的增殖有明显抑制作用. 相似文献
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目的研制抗人表皮生长因子受体突变体Ⅲ胞外区(EGFRvⅢex)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法采用原核表达的EGFRvⅢex蛋白免疫BALB/c小鼠,以间接ELISA法筛选分泌特异性mAb的杂交瘤细胞,采用蛋白印迹、间接免疫荧光和免疫组化染色鉴定mAb的特异性。结果获得1株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。mAb的Ig亚类为IgM,效价为10-6。mAb可识别U87细胞膜上稳定转染的人EGFRvⅢex和SPC-A1细胞膜上高表达的EGFR。结论成功制备1株抗EGFRvⅢex的mAb,经蛋白印迹、免疫荧光和免疫组化染色检测,mAb的特异性良好,能够检测细胞上的EGFR和EGFRvⅢex,为肿瘤的治疗提供了良好的手段。 相似文献