hTERTp/TK/pGL3靶向抑制端粒酶活性及其对鼻咽癌干细胞的杀伤作用

［摘 要］ 目的:探讨hTERTp/TK/pGL3载体靶向抑制端粒酶活性及其杀灭鼻咽癌CD133+干细胞的作用机制。方法:将已构建的hTERTp/TK/pGL3载体及其对照处理因素（CMV/TK/pGL3和TK/pGL3载体）转染至鼻咽癌CD133+干细胞、CD133－肿瘤细胞、人脐静脉内皮细胞(ECV)(对照组)和鼻咽癌SUNE未分选细胞中,采用Stretch PCR 法检测4种细胞端粒酶活性改变。MTT法测定CD133+干细胞和ECV细胞存活率。结果:CD133+鼻咽癌干细胞体外培养7 d后细胞逐渐增多,CD133+鼻咽癌干细胞体内成瘤实验阳性。CD133+鼻咽癌干细胞转染hTERTp/TK/pGL3或CMV/TK/pGL3后端粒酶活性降低;而ECV细胞端粒酶为阴性表达;CD133+鼻咽癌干细胞分别转染TK/pGL3、CMV/TK/pGL3和hTERTp/TK/pGL3后细胞存活率平均为（87.4±0.4）％、（20.5±0.4）％和（27.9±0.2）％,ECV对照细胞组转染TK/pGL3、CMV/TK/pGL3和hTERTp/TK/pGL3后细胞存活率平均为（90.7±0.1）％、（18.1±0.2）％和（86.2±0.1）％,hTERTp/TK/pGL3杀灭鼻咽癌CD133+干细胞效率明显高于ECV细胞组（P<0.01）。结论:hTERTp/TK/pGL3载体可以通过下调端粒酶活性靶向抑制端粒酶阳性的鼻咽癌CD133+干细胞。     

人鼻咽癌CD133+干细胞的生物学特性及意义**

背景：有研究表明肿瘤细胞株中存在肿瘤干细胞,是肿瘤复发、转移的根源,但人鼻咽癌细胞株CNE-2中肿瘤干细胞的表达及生物学特性至今少有报道。 目的：观察人鼻咽癌CD133+干细胞生物学特性及意义。 方法：采用流式细胞仪检测人鼻咽癌细胞株CNE-2中CD133的表达情况。免疫磁珠分选技术获得人鼻咽癌CD133+干细胞,分别采用无血清培养法、CCK-8法、平板克隆形成试验及裸鼠体内成瘤实验检测CD133+干细胞的体外增殖及体内成瘤能力,并将其与CD133-及未分选鼻咽癌细胞进行比较,以了解CD133+干细胞的生物学特性。 结果与结论：免疫磁珠富集的CD133+细胞在无血清培养基中呈悬浮生长,并可以形成肿瘤干细胞球。CD133+细胞与CD133-细胞比较具有较高的克隆形成能力(P < 0.01);CD133+细胞在裸鼠体内的成瘤率高于CD133-细胞(P < 0.05)。结果证实,鼻咽癌CD133+干细胞能在体外分离培养,形成干细胞球,增殖能力强,在裸鼠体内具有极强的成瘤能力。 关键词：鼻咽癌;肿瘤干细胞;增殖;生物学特性;干细胞培养 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.06.013     

端粒酶抑制因子PinX1基因在鼻咽癌细胞中的表达及作用效应分析

目的 探讨PinX 1基因在鼻咽癌细胞中的表达及其作用效应分析.方法 构建包含全长人PinX 1基因序列的质粒载体pEGFP-C 3-PinX 1及Pinx 1的小干扰RNA,PinX1-FAMsiRNA.脂质体法转染人鼻咽癌5～8F细胞,采用RT-PCR检测PinX 1基因和端粒酶催化亚单位( hTERT) mRNA...     

间充质干细胞靶向转运胸苷激酶基因联合更昔洛韦杀伤鼻咽癌细胞

背景：研究证实,间充质干细胞能通过基因修饰成为肿瘤治疗的靶向载体。目的：观察转染胸苷激酶基因的胸苷激酶-间充质干细胞联合更昔洛韦对鼻咽癌细胞的靶向杀伤作用。方法：应用LipofectamineTM2000将表达胸苷激酶基因的重组质粒pGL3-EGFP-胸苷激酶转染至SD大鼠间充质干细胞,观察其增殖能力。应用Transwell小室观察胸苷激酶-间充质干细胞的归巢特性;将胸苷激酶-间充质干细胞植入裸鼠,观察其致瘤性;用胸苷激酶-间充质干细胞/更昔洛韦干预人鼻咽癌细胞5-8F,观察其对细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果与结论：荧光显微镜观察及RT-PCR检测结果提示实验成功将胸苷激酶基因转染至间充质干细胞,CCK-8检测结果显示胸苷激酶-间充质干细胞与间充质干细胞增殖能力差异无显著性意义（P〉0.05）。Transwell小室迁移实验显示胸苷激酶-间充质干细胞具有归巢特性,裸鼠移植瘤实验显示胸苷激酶-间充质干细胞无致瘤性。CCK-8检测检测发现胸苷激酶-间充质干细胞/更昔洛韦具有旁观者效应,可明显降低5-8F的生存率（P〈0.01）。提示胸苷激酶-间充质干细胞/更昔洛韦对鼻咽癌细胞具有靶向迁移及杀伤作用,间充质干细胞可作为治疗鼻咽癌的理想靶向转运载体。     

人鼻咽癌CD133^＋干细胞的生物学特性及意义

背景：有研究表明肿瘤细胞株中存在肿瘤干细胞,是肿瘤复发、转移的根源,但人鼻咽癌细胞株CNE-2中肿瘤干细胞的表达及生物学特性至今少有报道。目的：观察人鼻咽癌CD133^＋干细胞生物学特性及意义。方法：采用流式细胞仪检测人鼻咽癌细胞株CNE-2中CD133的表达情况。免疫磁珠分选技术获得人鼻咽癌CD133^＋干细胞,分别采用无血清培养法、CCK-8法、平板克隆形成试验及裸鼠体内成瘤实验检测CD133^＋干细胞的体外增殖及体内成瘤能力,并将其与CD133-及未分选鼻咽癌细胞进行比较,以了解CD133^＋干细胞的生物学特性。结果与结论：免疫磁珠富集的CD133^＋细胞在无血清培养基中呈悬浮生长,并可以形成肿瘤干细胞球。CD133^＋细胞与CD133-细胞比较具有较高的克隆形成能力（P〈0.01）;CD133^＋细胞在裸鼠体内的成瘤率高于CD133-细胞（P〈0.05）。结果证实,鼻咽癌CD133^＋干细胞能在体外分离培养,形成干细胞球,增殖能力强,在裸鼠体内具有极强的成瘤能力。     

鼻咽癌患者外周血端粒酶hTERT mRNA的定量检测及其临床意义

目的定量检测鼻咽癌患者外周血中端粒酶逆转录酶催化亚单位（hTERT）mRNA的表达,并探讨其在鼻咽癌中的诊断及
治疗意义。方法采用实时荧光定量PCR技术（QPCR）检测33例鼻咽癌患者治疗（放疗或化疗）前后血浆中hTERT mRNA的表
达,并分析其与临床病理因素的关联,以24例健康志愿者作为对照。结果结果显示,健康志愿者血浆中hTERT mRNA相对表
达量为0.95±0.37,鼻咽癌患者血浆中hTERT mRNA含量达到10.75±4.29（P<0.05）。鼻咽癌患者血浆中hTERT mRNA的表达
与年龄、性别无统计学差异（P>0.05）,而与临床分期、T分期及N分期有显著性差异（P<0.05）。早期患者（Ⅰ、Ⅱ期）,放疗后其表
达量3.43±1.42 较治疗前5.60±2.33 明显下降;晚期患者（Ⅲ、Ⅳ期）诱导化疗及放疗后其表达量较治疗前12.68±3.08 分别降为
10.68±2.48、3.13±1.69（P<0.05）。结论鼻咽癌患者血浆中hTERT mRNA的表达明显升高,放化疗能够有效抑制该基因的表达,
而且该基因的含量与肿瘤的临床分期、大小及淋巴结浸润范围等临床病理因素密切相关,从而提示检测鼻咽癌患者外周血中
hTERT mRNA的含量,有可能为鼻咽癌患者早期诊断及疗效判断提供重要信息。
     

晚期鼻腔鼻窦腺样囊性癌21例临床特征分析

目的 探讨发生于鼻腔鼻窦晚期腺样囊性癌的临床特征、治疗方法、预后及影响因素.方法 分析2007年2月~2016年5月入住我院的21例晚期鼻腔鼻窦腺样囊性癌患者的临床资料,包括临床表现、临床分期、病理、治疗方法、局部复发、远处转移及预后等,并结合文献进行诊疗特征分析.采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验进行单因素生存分析,COX模型对影响预后的临床因素进行多因素分析.结果 21例患者中,实体型占比小于30%的有10例(47.6%),1、3、5年总生存率分别为100%、100%、71%,实体型占比大于等于30%的有11例(52.4%),1、3、5年总生存率分别为70%、40%、10%,两者差异有统计学意义(P=0.02),且实体型占比大于等于30%的患者预后较差.Log-rank检验及全变量模型下协变量的生存曲线表明病理分型对预后具有显著影响,T3期预后略优于T4期,源发于上颌窦略优于蝶窦,手术及放化疗综合治疗优于单纯手术及单纯放化疗.多因素Cox回归模型分析结果显示,病理分型、病程与预后关系密切(P=0.045、0.028).结论 鼻腔鼻窦腺样囊性癌发病率较低,症状表现无特异性,部分患者病程较长,多发鼻窦内,尤其是上颌窦,早期诊断较困难,等到就诊时多为晚期.晚期患者以手术结合术后放化疗的综合治疗方式为主.病理分型、病程、发病部位、分期、治疗方式、周围神经侵袭,手术切缘阳性,术后放疗剂量不足60 Gy可能是影响晚期腺样囊性癌患者预后的因素.     

Lenti-TK介导间充质干细胞对鼻咽癌CD133+干细胞的靶向迁移及杀伤作用

目的： 观察慢病毒-胸苷激酶（lentivirus-thymidine kinase,Lenti-TK)/间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC）对鼻咽癌CD133+干细胞的靶向迁移及杀伤作用。 方法： 构建包含TK基因的重组慢病毒表达载体Lenti-TK,感染MSC后得到Lenti-TK-MSC,RT-PCR及Western blotting检测Lenti-TK-MSC中HA-TK的表达。免疫磁珠法从鼻咽癌5-8F细胞中分选CD133+细胞;Transwell小室迁移实验检测Lenti-TK-MSC对CD133+5-8F细胞的趋向性;Lenti-TK-MSC联合更昔洛韦（ganciclovir,Lenti-TK-MSC/GCV）与CD133+5-8F细胞共培养,CCK-8试剂盒检测其对细胞的杀伤作用和旁观者效应。 结果： 成功构建重组慢病毒载体Lenti-TK,其滴度为1×108UT/ml,Lenti-TK（MOI=50）感染MSC 72 h时,感染效率达（95.1±01）%。Lenti-TK-MSC迁移至CD133+5-8F细胞组的细胞数明显多于CD133-5-8F细胞组、未分选5-8F细胞组\[（83.0±8.7） vs （29.6±53）、（38.3±5.2）,P=0.000\]。Lenti-TK-MSC/GCV处理组与单独GCV处理组、Lenti-TK-MSC/GCV条件培养液（即Lenti-TK-MSC加入1 mg/L GCV培养48 h的培养上清）处理组相比,CD133+5-8F细胞的存活率明显降低\[（37.2±2.3）% vs （98.5±3.1）%、（83.8±34）%,P=0.000\]。Lenti-TK-MSC数量达到混合细胞总数（Lenti-TK-MSC和CD133+5-8F细胞)的20%时,CD133+5-8F细胞存活率为（68.2±2.3）%,表现出明显的旁观者杀伤效应。 结论： Lenti-TK感染后MSC对鼻咽癌CD133+5-8F细胞具有靶向迁移及杀伤作用。     

Nod1与Nod2模式识别受体在鼻息肉发病中的作用

目的探讨核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide binding oligomerization do main,NOD)模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)Nod1、Nod2在鼻息肉发病中的作用。方法分别采用免疫组织化学及Western-blot检测Nod1、Nod2蛋白在20例鼻息肉组织中的表达,同时以19例正常下鼻甲黏膜作对照;ELISA检测鼻息肉组织和下鼻甲黏膜组织中白细胞介素4(IL-4)的含量。结果 Western-blot结果提示:鼻息肉组织Nod1表达高于对照组,两组Nod2无明显差异。免疫组织化学示两种模式受体在两组中均有表达,主要表达于黏膜上皮细胞、腺体上皮、炎性细胞(如嗜酸性粒细胞)中,但Nod1在鼻息肉中表达强于对照组(P<0.05),Nod2在两组中的表达差异无统计学意义。ELISA检测示鼻息肉组织匀浆液IL-4高于正常下鼻甲黏膜组织,(P<0.05)。结论在鼻息肉组织中,Nod1表达增强,说明Nod1有可能参与鼻息肉的发病。