PIAS3的Myc融合蛋白真核表达重组质粒的构建

目的：构建PIAS3 （活化型STAT3抑制蛋白）的Myc融合蛋白真核表达重组质粒，并表达融合蛋白Myc-PIAS3。方法： 采用PCR方法，扩增鼠PIAS3基因全长cDNA编码区序列。将该1 851 bp的特异性片段连接到T载体上，将其亚克隆至pCMV-Myc真核表达载体的SalⅠ和NotⅠ位点之间。将pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染前列腺癌PC3细胞，利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达。结果：重组pCMV-Myc-PIAS3质粒通过酶切和测序鉴定了其正确性。EcoRⅠ酶切鉴定时有4 357和1 318 bp 2条带，XbaⅠ酶切鉴定时有3 291 bp和2 384 bp 2条带，与预期结果一致。测序结果显示，13个氨基酸Myc在N端，然后是阅读框架正确的PIAS3的基因序列。pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染PC3细胞，利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达，在相对分子质量68 000处检测到特异的蛋白表达条带。结论：成功构建pCMV-Myc-PIAS3重组质粒，并表达融合蛋白Myc-PIAS3。     

pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒的构建与蛋白表达

目的:通过基因重组方法构建pCMV-Myc-PIASxβ质粒,在真核细胞中高效表达重组蛋白并进行检测。方法:用SalⅠ和NotⅠ将PIASxβ片段从pGADT7载体中酶切后,利用DNA重组技术将其定向插入pCMV-Myc载体中。获得正确重组质粒后,瞬转CHO细胞系,用Western blotting检测Myc-PIASxβ重组融合蛋白表达。结果:经过酶切,片段回收,连接转化,获得重组质粒。重组pCMV-Myc-PIASxβ克隆通过酶切和测序鉴定其正确性。EcoRⅠ酶切鉴定,pCMV-Myc-PIASxβ为一条大小5 641 bp的条带;XbaⅠ酶切鉴定,pCMV-Myc-PIASXβ为2条大小分别为3 291和2 349 bp 的条带,符合预计大小。Western blotting检测证实,在相对分子质量68 000处（PIASxβ融合蛋白）有特异的蛋白表达条带,与重组质粒相符。结论：成功构建了pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒,为深入研究PIAS家族的功能奠定良好的基础。