EM18-GST原核表达载体的构建及空间结构的生物信息学分析

目的构建GST—EMl8原核表达质粒,优化EM18-GST重组蛋白诱导表达条件,通过生物信息学预测EM18蛋白的空间结构。方法以pMDl8T／Eml8为模板,扩增EMl8基因的CDS区,构建pGEX一3X—EM18,设计不同诱导表达条件表达EM18GST蛋白。通过各种在线网站对EM18蛋门空间结构进行生物信息学预测。结果成功构建GST—EMl8原核表达质粒,以1mmol／LIPTG于37℃诱导4h,蛋白表达较好;生物信息学预测EM18蛋白N端为无规卷曲,之后紧连两个α螺旋,C末端为无规巷曲和较短的片层结构。结论成功构建了GSTEM18原核表达质粒,表达的EM18蛋白含有无规则卷曲,可能是抗原表位所在位置。     

应用噬菌体7肽库筛选泡球蚴Em18抗原模拟表位的初步研究

目的：从噬菌体7肽库中筛选泡球蚴Em18抗原模拟表位,为研究和开发新的包虫病诊断抗原提供实验依据.方法：用纯化后的rEm18-GST免疫新西兰白兔,获得抗rEm18-GST的多克隆抗体,进一步纯化,获得抗Em18多克隆抗体IgG,以之作为靶分子,免疫筛选噬菌体随机7肽库.经过5轮的淘筛过程,随机挑取9个蓝色噬菌斑扩增,核苷酸序列测定分析并与Em18进行同源性比较.结果：经5轮筛选后,阳性克隆得到富集,9个噬菌体克隆的氨基酸序列与Em18无同源性.结论：所得肽段可能是Em18抗原模拟表位.     

细粒棘球绦虫Eg95抗原基因疫苗体外瞬时表达及对小鼠诱导的免疫应答

目的　检测细粒棘球绦虫Eg95抗原基因疫苗(pcDNA3 Eg95)体外瞬时表达,探讨其诱导小鼠的体液和细胞免疫效果。　方法　pcDNA3 Eg95经脂质体转染HeLa细胞瞬时表达。逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测Eg95抗原信使RNA(mRNA)在HeLa细胞中的表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白质印迹法(Westernblot ting)检测Eg95蛋白的瞬时表达情况。pcDNA3 Eg95基因疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA检测IgG和IgG2a水平,四甲基偶氮唑盐试验(MTT法)检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖反应。　结果　RTPCR检测结果显示,pcD NA3 Eg95瞬时表达组有Eg95抗原基因mRNA表达,ELISA和Westernblotting检测结果表明,可在HeLa细胞中特异性表达Eg95蛋白。用pcDNA3 Eg95基因疫苗免疫BALB/c小鼠,第3周出现特异性IgG免疫应答,持续升高至第10周,显著高于对照组。从第2周开始,小鼠血清IgG2a应答即为阳性,且长时间(至第10周 )维持较高水平,与pcD NA3空质粒组比较,其差异具有非常显著性意义(P<0.01)。用原核表达的Eg95重组蛋白刺激免疫小鼠脾细胞,有明显的T细胞增殖反应。pcDNA3 Eg95基因疫苗免疫组刺激指数明显高于pcDNA3空质粒组(P<0.01)。结论　pcDNA3 Eg95基因疫苗可诱发小鼠产生特异的体液免疫和细     

复发性流产夫妇的染色体异常分析

自然流产连续发生2次或2次以上为复发性流产,其发生与遗传基因缺陷、解剖异常、内分泌紊乱、全身性疾病和免疫、环境因素有关,其中夫妇双方的染色体异常是主要原因之一。2000年1月-2008年12月,我们通过对1328对（2656例）复发性流产夫妇进行染色体核型分析,以探讨复发性流产与染色体异常的关系。     

环孢素A对小鼠Th17细胞分化的影响

目的：观察在抗CD3单克隆抗体（mAb）＋rIL-23刺激的条件下，环孢素A（CsA）对Th17细胞分化的影响。方法：小鼠脾淋巴细胞分别使用抗CD3mAb、抗CD3mAb＋rIL-23及抗CD3mAb＋rIL-23＋不同浓度的CsA刺激后，用ELISA检测IL-17和IFN-7的水平，并用流式细胞仪在单个细胞水平上检测产生IL-17的T细胞亚群。结果：单独抗CD3mAb能诱导少量的IL-17产生，加入IL-23后呈剂量依赖的方式明显增加IL-17的产生。CsA对抗CD3mAb＋rIL-23诱导的Th17细胞分化呈剂量依赖性的抑制作用。CsA不仅抑制早期Th17的分化，当细胞激活48小时后，CsA对Th17细胞的分化仍有抑制作用。CsA除了抑制Th17细胞分化外，对IFN-7和IL-2的产生也有抑制作用。此外，T细胞亚群分析的结果表明IL-17主要由CD4＋T细胞产生，而CD8＋T细胞几乎不产生IL-17。结论：CsA可以抑制Th17细胞的分化，进一步阐明了CsA免疫抑制及抗炎作用的机制，为临床上应用CsA提供科学理论和实验依据。     

Em18.3重组蛋白的表达及其免疫诊断特性的研究

目的：在大肠杆菌中表达和纯化截短的泡球蚴rEm18.3抗原重组蛋白,对其免疫诊断特性进行鉴定.方法： IPTG诱导pET41a-Em18.3原核表达质粒,表达和纯化rEm18.3-GST重组蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blot法对其进行初步鉴定,ELISA法确定其免疫诊断特性.结果： rEm18.3-GST重组蛋白得到成功表达,SDS-PAGE电泳显示相对分子量为45 kDa.Western blot结果表明,rEm18.3-GST重组蛋白能被AE病人阳性血清识别.对56例多房棘球蚴病（AE）、88例细粒棘球蚴病（CE）、24例其他寄生虫病、24例其他疾病和24例健康者共236份血清进行ELISA检测结果显示,对AE血清诊断的敏感性为10.7%,特异性为99.4%,阳性预测值85.7%,阴性预测值78.1%.结论： rEm18.3-GST免疫诊断价值较低,Em18抗原重要的表位可能位于1-40位氨基酸.     

LPS促进舌苔形成相关细胞凋亡的分子机制

目的探讨脂多糖影响舌苔形成相关细胞凋亡的分子机制。方法 LPS作用于撤血清舌鳞癌TCA-8113细胞,MTT法检测细胞增殖活性,Transwell研究细胞迁移,电镜观察细胞超微结构,ELISA检测PGE2含量,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,免疫印迹检测蛋白表达。结果 12.5~100mg/L LPS可显著抑制撤血清舌鳞癌TCA-8113细胞增殖活性和细胞迁移,呈剂量依赖性。100 mg/L LPS导致细胞表面微绒毛消失、细胞线粒体肿胀空泡化、细胞内出现白色脂质样空泡结构。LPS可以改变撤血清舌鳞癌TCA-8113细胞周期分布,促进细胞凋亡,25 mg/L和50 mg/L LPS可以上调NF-κB p65、Bax、COX-2表达水平,下调NF-κB p50、Bcl-2表达水平,促进PGE2分泌,抵抗细胞快速凋亡。结论 LPS可以促进舌苔形成相关细胞凋亡,与Cox-2信号通路可能存在交互作用。     

细粒棘球绦虫Eg95重组蛋白诱导小鼠免疫应答的研究

目的:探讨细粒棘球绦虫Eg95重组蛋白诱导小鼠的免疫应答效果。方法:设立Eg95重组蛋白免疫组(rEg95组)和对照组(NS组)小鼠分别注射Eg95重组蛋白、福氏佐剂和生理盐水,收集各组血清用酶联免疫吸附(ELISA法)检测IgG水平;采集脾细胞用四甲基偶氮唑盐试验(MTT法)检测免疫小鼠的淋巴细胞增殖反应。结果:Eg95重组蛋白免疫小鼠在第2次免疫后开始检测到抗Eg95抗原的IgG,并随着免疫次数的增多,血清抗体效价升高,在第1次免疫后第10周时,免疫抗体滴度可达到1∶25600。在第4次免疫后,进行淋巴细胞转化实验,MTT法检测证实Eg95重组蛋白免疫的小鼠,其脾细胞可在体外被特异性刺激增生。结论:细粒棘球绦虫Eg95重组蛋白可诱发小鼠产生特异的体液免疫和细胞免疫应答。     

抗泡球蚴重组Em18抗原多克隆抗体的纯化与鉴定

目的：制备抗泡球蚴18（Em18）抗原多克隆抗体,纯化并鉴定.方法：表达并纯化rEm18-GST蛋白.用纯化后的蛋白作为免疫原,免疫新西兰白兔获得抗rEm18-GST的多克隆抗体IgG,采用ELISA法检测抗体效价,进一步纯化抗体,获得抗Em18特异性多克隆抗体IgG,用Western blot及ELISA法检测并进行初步鉴定.结果：免疫制备获得兔抗rEm18-GST抗体,随着免疫次数的增加,抗体滴度不断升高,于第10周达到最高.ELISA检测抗体效价为1∶51 200.Western blot及ELISA法鉴定表明Em18-GST抗体去除了与GST的交叉反应.结论：获得了去除与GST交叉反应的抗Em18多克隆抗体,为进行噬菌体肽库筛选奠定基础.     

两种克隆方法在3种截短的泡球蚴Em18原核表达载体构建中的比较

目的比较3种截短的泡球蚴Em18基因聚合酶链反应(PCR)扩增产物经TA克隆和直接酶切2种方法,在原核表达质粒构建中的运用。方法PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的3种截短的泡球蚴Em18基因,经2种方法构建3种截短的Em18原核表达质粒：①PCR扩增产物与T载体连接构建T-Em18,重组质粒经EcoRⅠ/XhoⅠ酶切,电泳分离、纯化目的片段,再与经过EcoRⅠ/XhoⅠ酶切的原核表达载体pET41a( )连接；②PCR扩增产物经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切,电泳、纯化,直接与经过相同限制性内切酶酶切的pET41a( )连接。结果先经TA克隆,再经酶切构建3种截短的泡球蚴Em18原核表达载体获得成功。而采用直接酶切PCR扩增产物的构建方法未获得成功。结论TA克隆可用于对直接酶切效果不好的PCR扩增片段与表达载体的连接构建,方法简便高效,可提高带有限制性酶切位点的PCR扩增片段克隆人原核表达载体的效率。