MCP-1／CCR2通路参与骨髓基质细胞向脊髓全横断损伤区迁移的实验研究

【目的】探讨单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）及其受体CCR2在骨髓基质细胞（MSC）体内、外迁移中的作用。【方法】体外培养、纯化大鼠MSC，取第五代MSC行免疫荧光鉴定；免疫组化、RT-PCR检测纯化MSC表达CCR2情况；Boyden小室法检测趋化因子MCP-1（5～500ng／mL）对MSC的趋化迁移作用及其特异性。42只成年大鼠用于体内研究（脊髓全横断组24只，假手术组9只，正常大鼠9只），分别于术后1，3，7.14d取材，行免疫组化检测MCP-1表达，或行MCP-1的Real-timePCR定量分析，或颈内静脉注射荧光标记的MSC，观察MSC向脊髓迁移情况。【结果】第5代MSC都表达间充质干细胞标记物Vimentin、Laminin及Fibronectin；细胞免疫荧光、RT-PCR证实MSC表达趋化因子受体CCR2；MCP-1（5～500ng／mL）体外可趋化MSC迁移（P〈0．05），抗MCP-1抗体可对抗其趋化迁移作用（P〈0．05）。脊髓全横断组、对照组脊髓均表达MCP-1，但细胞分布、染色存在差异。影响MCP-1定量。脊髓损伤后趋化因子MCP-1RNA在1d、3d及7d较对正常对照组差异有统计学意义（P〈0．05）。术后14d时MCP-1 RNA与正常对照相比差异无统计学意义（P〉0．05），伴随其变化，脊髓损伤区迁移MSC较对照差异有统计学意义（P〈0．05）。【结论】MCP-1体内、外可趋化MSC迁移．MCP-1／CCR2通路参与MSC向脊髓全横断损伤区的迁移。     

骨髓基质细胞移植促进脊髓全横断损伤区神经元轴突的再生变化

背景:近年来,部分学者证明骨髓基质细胞移植可促进轴突再生,改善脊髓损伤引起的运动功能障碍,但目前关于移植骨髓基质细胞如何促进轴突再生,移植细胞与再生轴突的关系尚不清楚.目的:通过免疫荧光组织化学和免疫电镜的方法,探讨移植骨髓基质细胞促进脊髓全横断损伤区轴突再生的机制.设计、时间及地点:随机对照动物实验,细胞学体内观察,于2006-03/2007-06在新加坡国立大学解剖系完成.材料:清洁级Wistar新生大鼠1只,用于骨髓基质细胞培养.清洁级成年雌性Wistar大鼠36只,无菌条件下显露、切断脊髓T_(10),制备脊髓全横断损伤模型.方法:通过传代法培养、纯化骨髓基质细胞.36只成年Wistar雌性大鼠随机投币法分为移植组和对照组,每组18只.移植组大鼠脊髓全横断损伤9 d后以1×10~(11)L~(-1)的密度移植骨髓基质细胞,缺损区5μL,损伤区上、下1 mm处各2.5 μL,对照组动物在相同部位注射等量DMEM完全培养基,注射速度1 μL/min.主要观察指标:①移植骨髓基质细胞存活、分化情况.②轴突再生情况.③移植组和对照组宿主自身的nestin、NF200、GFAP和CNP阳性细胞在脊髓损伤区存活情况.④内源性CNP阳性细胞和再生纤维关系.结果:骨髓基质细胞移植2周时,脊髓损伤区可见大量CFDA-SE标记的移植细胞,随时间延长,存活的移植细胞数目逐渐降低,考虑脊髓损伤区内大量的0×42阳性吞噬细胞,激活小胶质细胞及空洞可能影响移植细胞的存活.虽然骨髓基质细胞数目逐渐降低,骨髓基质细胞移植可促进损伤区轴突的再生,而且还可促进宿主自身的nestin、NF200、GFAP和CNP阳性细胞在脊髓损伤区存活.宿主自身CNP和许旺细胞促进损伤轴突的再生和髓鞘形成.结论:移植骨髓基质细胞移植可促进宿主自身CNP和许旺细胞在脊髓损伤区存活,后者具有促进损伤轴突再生和髓鞘形成的作用.     

基质细胞来源因子1及其受体CXCR4参与骨髓基质细胞向脊髓全横断损伤区的迁移

背景：骨髓基质细胞具有体内、外迁移特性,但目前关于其迁移的具体机制还不十分清楚。 目的：探讨基质细胞来源因子1及其受体CXCR4在骨髓基质细胞体内、外迁移中的作用。 设计、时间及地点：细胞学体内实验,于2007-03/06在新加坡国立大学解剖系完成。 材料：清洁级Wistar新生大鼠1只,用于骨髓基质细胞培养。清洁级成年Wistar大鼠40只,随机分为损伤模型组、假手术组,20只/组。 方法：骨髓基质细胞体外趋化实验在48孔Boyden小室上进行,取25 µL基质细胞来源因子1,分别以5,50,500 µg/L质量浓度加到趋化板的下层,以8 µm孔径的聚碳酸酯膜覆盖;并设立空白对照,单纯添加DMEM条件培养基。以含牛血清白蛋白的DMEM条件培养基调整细胞浓度至1.5×109 L-1,50 µL细胞悬液加到Boyden小室上层,37 ℃、CO2培养箱培养10 h。损伤模型组大鼠制备脊髓全横断损伤,假手术组大鼠只打开椎板。脊髓全横断后1 h,将5-(6-)羟基荧光素双乙酸琥珀酰亚胺酯荧光标记的骨髓基质细胞悬液1.0 mL(1×109 L-1)经颈内静脉注入体内。 主要观察指标：免疫荧光组化染色观察骨髓基质细胞趋化因子受体CXCR4的表达,基质细胞来源因子1体外对骨髓基质细胞的趋化迁移作用,Real-time PCR定量检测脊髓损伤区基质细胞来源因子1 RNA的表达,荧光显微镜下观察骨髓基质细胞向脊髓损伤区的体内迁移。 结果：纯化的骨髓基质细胞呈CXCR4阳性。与空白对照比较,5,50,500 µg/L基质细胞来源因子1均可明显促进骨髓基质细胞的体外趋化迁移(P < 0.05),且质量浓度为50 µg/L时趋化作用达峰值。与假手术组比较,损伤模型组造模后7 d基质细胞来源因子1 RNA的表达明显升高(P < 0.05),14 d时恢复至正常水平。细胞注射2周后与假手术组比较,损伤模型组损伤区迁移细胞数明显增加(P < 0.05)。 结论：基质细胞来源因子1体内、外可趋化骨髓基质细胞迁移,基质细胞来源因子1及其受体CXCR4参与骨髓基质细胞向脊髓全横断损伤区的迁移。     

趋化因子SDF-1体外趋化骨髓基质细胞迁移的实验研究

目的探讨趋化因子SDF-1在体外对骨髓基质细胞的迁移作用。方法采用全骨髓法培养成年Wistar大鼠骨髓基质细胞。取第五代骨髓基质细胞行免疫荧光鉴定；后通过细胞免疫荧光及RT-PCR的方法检测骨髓基质细胞表达趋化因子受体CXCR4的情况．利用Boyden小室法探讨趋化因子SDF-1对骨髓基质细胞的体外趋化作用及其特异性。结果第五代骨髓基质细胞都表达间充质干细胞标记物Vimentin、Laminin及Fibronectin；细胞免疫荧光及RT-PCR结果证实骨髓基质细胞表达趋化因子受体CXCR4；趋化因子SDF-1（5、50、500ng／mL）体外可趋化骨髓基质细胞迁移，抗SDF-1多克隆抗体可对抗其趋化迁移作用。结论SDF-1／CXCR4通路参与骨髓基质细胞体外迁移，为进一步研究骨髓基质细胞的迁移机制提供了理论依据。     

MCP-1/CCR2通路参与骨髓基质细胞向脊髓全横断损伤区迁移的实验研究

 【目的】 探讨单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）及其受体CCR2在骨髓基质细胞（MSC）体内、外迁移中的作用。【方法】体外培养、纯化大鼠MSC，取第五代MSC行免疫荧光鉴定；免疫组化、RT-PCR检测纯化MSC表达CCR2情况；Boyden 小室法检测趋化因子MCP-1（5～500 ng/mL）对MSC的趋化迁移作用及其特异性。42只成年大鼠用于体内研究（脊髓全横断组24只，假手术组9只，正常大鼠9只），分别于术后1，3，7，14d取材，行免疫组化检测MCP-1表达，或行MCP-1的Real-time PCR定量分析，或颈内静脉注射荧光标记的MSC，观察MSC向脊髓迁移情况。【结果】第五代MSC都表达间充质干细胞标记物Vimentin、Laminin及Fibronectin；细胞免疫荧光、RT-PCR证实MSC表达趋化因子受体CCR2；MCP-1（5～50 ng/mL）体外可趋化MSC迁移（P﹤0.05），抗MCP-1抗体可对抗其趋化迁移作用（P﹤0.05）。脊髓全横断组、对照组脊髓均表达MCP-1，但细胞分布、染色存在差异，影响MCP-1定量。脊髓损伤后趋化因子MCP-1RNA在1d、3d及7d较对正常对照组差异有统计学意义（P <0.05），术后14d时MCP-1RNA与正常对照相比差异无统计学意义（P ＞0.05），伴随其变化，脊髓损伤区迁移MSC较对照差异有统计学意义（P﹤0.05）。【结论】 MCP-1体内、外可趋化MSC迁移，MCP-1/CCR2通路参与MSC向脊髓全横断损伤区的迁移。     

基质细胞来源因子1及其受体CXCR4参与骨髓基质细胞向脊髓全横断损伤区的迁移

背景:骨髓基质细胞具有体内、外迁移特性,但目前关于其迁移的具体机制还不十分清楚.目的:探讨基质细胞来源因子1及其受体CXCR4存骨髓基质细胞体内、外迁移中的作用.设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2007-03/06在新加坡国立大学解剖系完成.材料:清洁级Wistar新生大鼠1只,用于骨髓基质细胞培养.清洁级成年Wistar大鼠40只,随机分为损伤模型组、假手术组,20只/组.方法:骨髓基质细胞体外趋化实验在48孔Boyden小室上进行,取25 μL基质细胞来源因子1,分别以5,50,500 μg/L质量浓度加到趋化板的下层,以8 μm孔径的聚碳酸酯膜覆盖;并设立空白对照,单纯添加DMEM条件培养基.以含生血清白蛋白的DMEM条件培养基调整细胞浓度至1.5×109L-1,50 μL细胞悬液加到Boyden小窜上层,37℃、CO2培养箱培养10 h.损伤模型组大鼠制各脊髓全横断损伤,假手术组大鼠只打开椎板.脊髓全横断后1 h,将5-(6-)羟基荧光素双乙酸琥珀酰亚胺酯荧光标记的骨髓基质细胞悬液1.0 mL(1×109L-1)经颈内静脉注入体内.主要观察指标:免疫荧光组化染色观察骨髓基质细胞趋化因子受体CXCR4的表达,基质细胞来源因子1体外对骨髓基质细胞的趋化迁移作用,Real-time PCR定量检测脊髓损伤区基质细胞来源因子1 RNA的表达,荧光显微镜下观察骨髓基质细胞向脊髓损伤区的体内迁移.结果:纯化的骨髓基质细胞呈CXCR4阳性.与空白对照比较,5,50,500 μg/L基质细胞来源因子1均可明显促进骨髓基质细胞的体外趋化迁移(P<0.06),且质量浓度为50 μg/L时趋化作用达峰值.与假手术组比较,损伤模型组造模后7 d基质细胞来源因子1 RNA的表达明显升高(P<0.05),14 d时恢复至正常水平.细胞注射2周后与假手术组比较,损伤模型组损伤区迁移细胞数明显增加(P<0.05).结论:基质细胞来源因子1体内、外可趋化骨髓基质细胞迁移,基质细胞来源因子1及其受体CXCR4参与骨髓基质细胞向脊髓全横断损伤区的迁移.     

Nestin 和GFAP在缺氧大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达及高氧治疗的作用

目的： 探讨巢蛋白（nestin）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在缺氧大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达情况及高氧治疗对其表达的影响。方法: 制作大鼠缺氧模型及缺氧后高氧治疗模型,行眼球矢状位切片及视网膜铺片,行GS/nestin、GS/GFAP、GFAP/nestin免疫荧光双标染色。结果: 正常大鼠视网膜中几乎看不到nestin阳性染色,GFAP阳性染色仅位于星形胶质细胞上。缺氧后,在Müller细胞和星形胶质细胞上出现了nestin的表达,GFAP的表达没有明显变化。高氧治疗后,nestin在Müller细胞上的表达明显减弱,但在星形胶质细胞上仍有较强的表达。GFAP仍然只在星形胶质细胞上表达。结论: Müller细胞和星形胶质细胞针对缺氧损伤和高氧处理发生不同的细胞骨架蛋白重塑,这与它们和视网膜神经节细胞以及视网膜血管在解剖和功能关系上的差异有关。     

骨髓基质细胞移植促进脊髓全横断损伤区神经元轴突的再生变化☆○

背景：近年来,部分学者证明骨髓基质细胞移植可促进轴突再生,改善脊髓损伤引起的运动功能障碍,但目前关于移植骨髓基质细胞如何促进轴突再生,移植细胞与再生轴突的关系尚不清楚。 目的：通过免疫荧光组织化学和免疫电镜的方法,探讨移植骨髓基质细胞促进脊髓全横断损伤区轴突再生的机制。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,细胞学体内观察,于2006-03/2007-06在新加坡国立大学解剖系完成。 材料：清洁级Wistar新生大鼠1只,用于骨髓基质细胞培养。清洁级成年雌性Wistar大鼠36只,无菌条件下显露、切断脊髓T10,制备脊髓全横断损伤模型。 方法：通过传代法培养、纯化骨髓基质细胞。36只成年Wistar雌性大鼠随机投币法分为移植组和对照组,每组18只。移植组大鼠脊髓全横断损伤9 d后以1×1011 L-1的密度移植骨髓基质细胞,缺损区5 μL,损伤区上、下1 mm处各2.5 μL,对照组动物在相同部位注射等量DMEM完全培养基,注射速度1 μL/min。 主要观察指标：①移植骨髓基质细胞存活、分化情况。②轴突再生情况。③移植组和对照组宿主自身的nestin、NF200、GFAP和CNP阳性细胞在脊髓损伤区存活情况。④内源性CNP阳性细胞和再生纤维关系。 结果：骨髓基质细胞移植2周时,脊髓损伤区可见大量CFDA-SE标记的移植细胞,随时间延长,存活的移植细胞数目逐渐降低,考虑脊髓损伤区内大量的OX42阳性吞噬细胞/激活小胶质细胞及空洞可能影响移植细胞的存活。虽然骨髓基质细胞数目逐渐降低,骨髓基质细胞移植可促进损伤区轴突的再生,而且还可促进宿主自身的nestin、NF200、GFAP和CNP阳性细胞在脊髓损伤区存活。宿主自身CNP和许旺细胞促进损伤轴突的再生和髓鞘形成。 结论：移植骨髓基质细胞移植可促进宿主自身CNP和许旺细胞在脊髓损伤区存活,后者具有促进损伤轴突再生和髓鞘形成的作用。     

胶质纤维酸性蛋白在视神经横断后大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达

目的探讨胶质纤维酸性蛋白（GFAP）存视神经横断后大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达情况及可能的意义。方法制作大鼠视神经横断模型,分别于术后1、3、7d取材,制作视网膜矢状伉冰冻切片,用谷氨酰胺合成酶（Gs）标记视网膜Muller细胞,行GS／GFAP免疫荧光双标。提取视网膜总RNA行GFAPReal—TimePCR半定量分析。结果正常大鼠视网膜中GFAP阳性染色仅位于视网膜内层的星形胶质细胞上。术后1d,在Muller细胞上出现GFAP的诱导表达,术后3d,GFAP在Muller细胞上的表达进一步增强,术后1周,GFAP在Muller细胞上的表达保持在较高水平,Real-TimePCR半定量分析与以上结果吻合。结论视神经横断后GFAP在Muller细胞上的诱导表达是Muller细胞对视网膜损伤产生的一种胶质化反应,GFAP的表达量与病程进展相一致。GFAP在Muller细胞上的诱导表达尤其在足板处的强烈表达可能对视网膜神经节细胞具有保护作用。