Effects of Astragaloside in Treating Myocardial Injury and Myocardial Sarco/Endoplasmic Ca~( 2 )-ATPase of Viral Myocarditis Mice

Effects of Astragaloside in Treating Myocardial Injury and Myocardial Sarco/Endoplasmic Ca~( 2 )-ATPase of Viral Myocarditis Mice@陆曙 @张寄南 @杨笛 @徐晋丹 @陈相健 @方五旺 @马文珠     

正常SD大鼠心血管系统内皮素转换酶表达水平及意义

目的：探讨正常ＳＤ大鼠心脏及血管（动脉、静脉）内皮素转换酶（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ ＥＣＥ）ｍＲＮＡ的分布。方法：半定量ＲＴ－ＰＣＲ法检测组织中的ＥＣＥ ｍＲＮＡ,同时以甘油醛－３－磷酸脱氢酶（Ｇｌｙｃｅｒ－ａｌｄｅｌｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ,ＧＡＰＤＨ）作内参照。结果：正常ＳＤ大鼠心脏各部位及血管（动脉、静脉）ＥＣＥ ｍＲＮＡ的     

T型钙通道在心肌肥厚大鼠心肌细胞钙内流中的作用

目的研究T型钙通道在心肌细胞钙离子内流中的作用及其对心脏兴奋收缩耦联的可能影响。方法测定选择性T型钙通道阻滞剂米贝拉地尔对培养的SD乳大鼠心室肌细胞和二肾一夹心肌肥厚大鼠心室肌细胞[Ca2+]i的影响。结果血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激使乳大鼠心室肌舒张期细胞[Ca2+]i增高,收缩期细胞[Ca2+]i降低,[Ca2+]i上升和下降的时间延长。米贝拉地尔1.25～5μmol·L-1浓度依赖性降低AngⅡ引起的细胞[Ca2+]i变化。在心肌肥厚模型大鼠,咖啡因刺激后,[Ca2+]i增幅和最高[Ca2+]i明显降低。而米贝拉地尔25mg·kg-1·d-1(灌胃给药7～9周)组加入咖啡因刺激后细胞内[Ca2+]i增幅和最高[Ca2+]i明显增高。结论T型钙通道异常开放可以引起心肌细胞内钙超载。阻断T型钙通道,可能通过改善肌浆网摄取及释放钙的功能而抑制心肌细胞钙超载。     

大鼠心肌组织中高能磷酸化物的含量测定

目的 建立了同步测定大鼠心肌组织中5种高能磷酸化物含量的反相离子对高效液相色谱法,并观察异丙肾上腺素致害大鼠心肌损伤模型中能量代谢的变化。方法 色谱柱:Supelco ODS-C₁₈(250mm×4.6mm,5μm);柱温:23℃～25℃;UV检测波长210nm;流动相:220mmol·L^-1磷酸盐缓冲液(含3mmol·L^-1四丁基氢氧化铵和7%甲醇),pH6.5;流速1.2ml·min^-1和1.3ml·min^-1。结果 5种能量代谢物质ATP、ADP、AMP、CrP和Cr达到良好分离,ATP、ADP、CrP在10～100μmol·L^-1,AMP在100～500μmol·L^-1,Cr在100～1000μmol·L^-1浓度范围,峰面积与浓度呈良好线性关系。日内和日间精密度的RSD均<10%,ATP、ADP、AMP、CrP及Cr的提取回收率(%)平均为:97.86、104.38、100.00、97.64和98.8。与生理盐水组相比,ISO致害大鼠心室组织中ATP含量及能荷(EC)显著下降(P<0.05)、ADP呈下降而AMP呈上升趋势，CrP含量显著上升（P<0.01）。结论 本法操作简便、结果准确，可以用于大鼠心肌组织提取液中高能磷酸化物的测定和能量代谢状况的研究。     

培哚普利对肾血管性高血压大鼠心肌钙调神经磷酸酶及丝裂原活化蛋白激酶的影响

目的研究两肾一夹高血压大鼠心肌肥厚过程中钙调神经磷酸酶(CaN)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK，包括胞外信号调节激酶、c-Jun NH2-末端激酶、p38丝裂原活化蛋白激酶)的变化，探讨血管紧张素转换酶抑制剂培哚普利对心肌肥厚和CaN、MAPK的影响。方法制作两肾一夹高血压大鼠模型；以左心室重、左心室重与体重比值、心肌细胞横截面积、左心室后壁和室间隔厚度作为大鼠心肌肥厚指标；应用RT-PCR法测定大鼠心肌CaN和MAPK mRNA表达，采用免疫印迹法检测CaN蛋白表达，以对硝基苯磷酸作底物测定CaN活性。结果两肾一夹术后2个月大鼠已发生心肌肥厚，术后3个月心肌肥厚进一步加重；手术组大鼠左心室心肌CaN mRNA、蛋白表达和CaN活性以及c-Jun NH2-末端激酶mRNA表达均高于同龄假手术组。培哚普利治疗可逆转大鼠心肌肥厚和CaN、c-Jun NH2-末端激酶的变化。结论培哚普利可通过抑制胞内CaN和c-Jun NH2-末端激酶信号通路逆转两肾一夹高血压大鼠心肌肥厚。     

应用聚合酶链反应技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体

目的:利用聚合酶链反应定点突变技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体。方法:实验于2005-03/06在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。选择南京医科大学第一附属医院体检中心健康体检者血标本提取人基因组DNA,设计、合成两对引物,将突变位点设计在引物内,突变位点包含限制性内切酶BseNI酶切位点,采用聚合酶链式反应定点突变技术,应用高保真TaqDNA聚合酶,通过三轮聚合酶链扩增反应对血小板反应素1基因的第13外显子进行扩增,将第13外显子碱基8831A置换为G,对最终扩增产物进行酶切鉴定和测序。结果:获得人血小板反应素1第13外显子编码钙结合域突变体,经酶切鉴定和测序分析,除引入突变点产生预期A8831→G突变外,其余碱基序列无改变。结论:采用聚合酶链反应体外定点突变技术,成功构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体,为研究血小板反应素1基因该位点突变导致血小板反应素1蛋白的结构、功能变化奠定了基础。     

黄芪总皂苷对异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤的保护作用

 目的研究黄芪总皂苷(astragalosides,AS)对异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)致大鼠心肌损伤的影响及机制。方法用AS(5mg·kg^-1·d^-1×7d,ip)或曲美他嗪(10mg·kg^-1·d^-1×7d,ip)等治疗ISO(5mg·kg^-1·d^-1×2d,sc)心肌损伤大鼠,观察心肌组织病理改变并测定心肌组织乳酸、丙二醛及高能磷酸化物ATP,ADP和AMP含量。结果AS组心肌组织病理分级接近曲美他嗪对照治疗组,心肌乳酸和丙二醛含量较模型组显著降低(分别为P<0.05,P<0.01),ATP含量增加(P<0.05),ADP含量降低(P<0.05),AMP含量有增加趋势,以上治疗指标与曲美他嗪组比较无显著差异(P>0.05)。结论AS可拮抗ISO引起的大鼠心肌损伤,其机制与改善心肌能量代谢、抑制脂质过氧化有关。     

构建检测心肌肌钙蛋白Ⅰ基因Arg145Trp突变的寡核苷酸探针*☆

目的：等位基因特异性寡核苷酸杂交是基于分子杂交原理而建立的经典的突变检测方法，也是DNA芯片技术的重要组成部分，常用于突变筛查。实验拟建立一种适合快速大规模检测心肌肌钙蛋白Ⅰ基因Arg145Trp突变(C4693T)的方法。 方法：实验于2002-07/2004-06在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所临床生物学诊断与治疗实验室完成。直接测序研究证实的具有cTnⅠ基因Arg145Trp突变的肥厚型心肌病患者2例，正常对照1名，受试者对实验均知情同意。自外周血白细胞抽提DNA，聚合酶链反应扩增心肌肌钙蛋白Ⅰ基因含有突变位点的外显子，点于硝纤膜上，分别在不同的温度条件（48，52，56 ℃）下再与生物素标记的突变及野生探针杂交，摸索最佳杂交条件。根据最佳杂交条件，分别在100倍浓度无关探针条件下行非特异性竞争杂交，在100倍浓度未标记的特异寡核苷酸探针条件下行特异性竞争杂交。 结果：采用碱性磷酸酶标记的链霉亲和素和NBT/BCIP观察杂交结果：①突变及野生探针在48 ℃ 杂交时，除阴性对照外，2个患者及正常对照样本均见明显阳性信号。②在52 ℃ 及56 ℃ 条件下突变探针正确检出两个突变样本，但以56 ℃ 结果最佳。③100倍浓度无关探针杂交存在时，对生物素标记的突变寡核苷酸探针杂交结果没有影响，2个患者样本均见明显阳性信号。100倍浓度未标记的突变寡核苷酸探针存在时杂交，完全抑制生物素标记的突变寡核苷酸探针杂交结果。 结论：所设计的寡核苷酸探针能够检测出肥厚型心肌病患者心肌肌钙蛋白Ⅰ基因Arg145Trp突变（C4693T），适合该突变的快速大规模筛选。     

黄芪总皂甙对培养大鼠心肌细胞钙超载的影响

目的：研究黄芪总皂甙是否对培养大鼠心肌细胞钙超载产生影响，为研究和开发中药的新成分提供理论依据。方法：异丙肾上腺素干预培养大鼠(1～3d的SD乳大鼠80只)心肌细胞造成心肌细胞钙超载的模型，同时用黄芪总皂甙、维拉帕米和美托洛尔分别作用于细胞72h。分为异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)组，黄芪总皂甙1(astragaosidesl，ASl)组，AS2组，ISO+ASl组，ISO+AS2组，[SO+美托洛尔(metoprolol，M)组，ISO+维拉帕米(verapamil，V)组及正常对照组(control，C)组。检测肌细胞内游离钙离子浓度和肌质网的钙负荷，测定心肌细胞内脂质过氧化物丙二醛(maleic dialdehvde，MDA)的含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性。结果：异丙肾上腺素引起心肌细胞游离钙离子浓度和肌质网钙负荷明显增加(分别增加89％和116％)。黄芪总皂甙可浓度依赖性的抑制异丙肾上腺素的作用，从低浓度(10mg／L)到高浓度(100mg／L)。与ISO组比较，ISO+AS1组与ISO+AS2组可使细胞内的钙离子浓度分别降低37％和50％[(169．2&;#177;24．2)，(132．6&;#177;29．2)，(267．6&;#177;82．0)nmol／L，t=2．57，P&;lt;0．05；t=3．81，P&;lt;0．01]，使肌质网钙负荷分别降低23％和35％(P&;gt;0．05；t=2．48，P&;lt;0．05)，但是黄芪总皂甙的这种作用不如维拉帕米，美托洛尔可基本阻断异丙肾上腺素的作用。异丙肾上腺素使心肌细胞内的丙二醛含量增加(t=2．57，P&;lt;0．05)，黄芪总皂甙对异丙肾上腺素引起的丙二醛的增加有降低趋势，并对SOD的活性有增加趋势。结论：黄芪总皂甙可抑制异丙肾上腺素引起的心肌细胞钙超载，机制之一是黄芪总皂甙减少了心肌细胞肌质网的钙负荷，并抑制了脂质过氧化。