类风湿关节炎与原发性干燥综合征重叠患者继发间质性肺疾病的临床特点分析

目的 探讨类风湿关节炎（RA）与原发性干燥综合征（pSS）重叠患者继发间质性肺疾病（ILD）的临床特点、影像评分及预后的影响。方法 回顾性收集 43 例 RA 和 pSS 重叠（RA-pSS）患者的临床资料及肺高分辨率 CT（HRCT）资料,其中RA-pSS继发ILD组15例,RA-pSS未继发ILD组28例。2组患者年龄、性别、病程比较差异无统计学意义。观察RA-pSS患者的临床资料、肺功能、影像学改变,并对肺HRCT进行评分,分析RA-pSS继发ILD的临床、影像学特点及预后。结果 与RA-pSS未继发ILD组相比,RA-pSS继发ILD患者的C反应蛋白水平明显升高（P＜0.05）;RA-pSS 继发 ILD 组肺 HRCT 最常见的表现是小叶间隔增厚,最常见的 ILD 类型为非特异性间质性肺炎（NSIP）;与非普通型间质性肺炎（非-UIP）组相比,UIP组临床-影像-生理评分（CRP score）明显升高（P＜0.05）;与RA-pSS未继发ILD组相比,RA-pSS继发ILD组的生存率明显降低（P＜0.01）。结论 RA-pSS继发ILD患者炎性指标C反应蛋白水平更高,影像学表现复杂,预后差,应该得到临床的重视。     

α-胞衬蛋白siRNA对干燥综合征模型NOD小鼠IFN-γ和IL-4表达水平及基因沉默效果的影响

目的： 观察α-胞衬蛋白（α-Fodrin）特异性小干扰RNA（siRNA）对干燥综合征（SS）动物模型非肥胖糖尿病(NOD）小鼠细胞因子IFN-γ和IL-4表达水平的影响,探讨α-Fodrin siRNA治疗NOD的可能性。方法： 12只NOD雌性小鼠随机分为对照组、空载体组、α-Fodrin siRNA1组和α-Fodrin siRNA2组,每组3只。将成功构建的α-Fodrin siRNA1和α-Fodrin siRNA2表达载体分别经尾静脉注射α-Fodrin siRNA1组和α-Fodrin siRNA2组NOD小鼠,对照组和空载体组小鼠分别注射同等剂量的PBS和pGFP-V-RS空载体,测定每周每只小鼠的饮水量。注射后1、3、5和7 d,各组小鼠尾部采血,ELISA法检测4组小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-4的表达水平, RT-PCR法检测NOD小鼠肺脏组织中α-Fodrin mRNA的表达水平,免疫组织化学法检测NOD小鼠肺脏组织中α-Fodrin的表达水平。结果：4组小鼠饮水量比较差异无统计学意义(P>0.05)。注射后1和3 d,siRNA1组和siRNA2组NOD小鼠血清中IL-4水平明显升高、IFN-γ/IL-4比值减低,与对照组和空载体组比较差异有统计学意义（P<0.05）,对照组与空载体组比较差异无统计学意义,siRNA1组与siRNA2组比较差异亦无统计学意义;注射后5和7 d,4组小鼠血清中IL-4水平和IFN-γ/IL-4比值比较差异无统计学意义。注射后7 d,siRNA1组和siRNA2组 NOD小鼠肺脏组织中α-Fodrin及其 mRNA的表达水平明显低于对照组和空载体组（P<0.05）,对照组和空载体组比较差异无统计学意义,siRNA1组和siRNA2组比较差异无统计学意义。结论： NOD小鼠注射α-Fodrin siRNA载体后,血清中IL-4的水平升高、IFN-γ/IL-4的比值降低,同时α-Fodrin mRNA表达水平和α-Fodrin表达水平下降,提示α-Fodrin siRNA可以通过减轻NOD小鼠炎症反应延缓SS病情进程。     

α-胞衬蛋白siRNA对干燥综合征模型NOD小鼠血清中IL-2、IL-6和TGF-β的影响

目的:观察α-胞衬蛋白(α-Fodrin)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对干燥综合征动物模型非肥胖糖尿病(NOD)小鼠细胞因子IL-2、IL-6和TGF-β的影响及泪腺的病理改变。方法:0.5 mg/kg体重的pGFPV-RS空载体和α-Fodrin-siRNA表达载体分别尾静脉注射NOD小鼠,1周/次,共2次。注射后2、4、6 d尾部采血,酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中细胞因子IL-2、IL-6和TGF-β的表达;注射后7 d病理切片,苏木精-伊红(HE)染色法观察各组小鼠泪腺的病理变化。结果:注射后2 d和4 d siRNA 1组和siRNA2组NOD小鼠血清中IL-6的浓度明显低于对照组和空载体组,差异有统计学意义;而对照组和空载体组间、siRNA 1组和siRNA 2组间比较差异无统计学意义。注射后2、4和6 d siRNA 1组和siRNA 2组NOD小鼠血清中TGF-β和IL-2的浓度较对照组和空载体组升高,但差异无统计学意义。病理切片结果显示,siRNA 1组和siRNA 2组与对照组和空载体组比较,小鼠泪腺淋巴细胞浸润减少。结论:NOD小鼠注射α-Fodrin siRNA载体后,血清中IL-6的水平降低、IL-2和TGF-β的浓度升高,泪腺淋巴细胞浸润减少,提示α-Fodrin siRNA可以减轻炎症反应。     

PC对CIA小鼠关节的保护作用研究

目的：研究蛋白C(PC)对胶原诱导的关节炎（CIA）的影响及其是否通过内皮细胞蛋白C受体（EPCR）通路发挥作用。方法：构建CIA小鼠模型，并随机分为CIA模型组和CIA+PC组。CIA+PC组预防性给予PC,CIA模型组不做任何处理。应用量化评分评估PC对足肿胀的缓解程度；Micro-CT、HE染色、甲苯胺蓝染色观察小鼠骨/软骨破坏情况；双重免疫荧光法检测EPCR在小鼠滑膜组织中的表达情况；应用siEPCR腺病毒载体干扰EPCR蛋白表达，观察其对PC作用的影响。结果：PC干预CIA小鼠后，小鼠的临床评分降低，足爪肿胀程度减轻，骨侵蚀缓解；在CIA小鼠和DBA1小鼠的关节滑膜组织中检测到EPCR表达，且CIA小鼠EPCR表达明显低于DBA1小鼠。PC+siEPCR腺病毒载体干预CIA小鼠后，CIA小鼠临床评分无明显降低，关节症状未得到有效缓解。结论：PC可改善CIA小鼠的关节症状，进而缓解CIA疾病进展。而siEPCR可逆转PC的这种保护作用，因此PC缓解CIA疾病进展依赖于EPCR蛋白表达。     

TNF-α及其可溶性受体在系统性红斑狼疮中的临床意义

目的：了解系统性红斑狼疮（SLE）患者血清中肿瘤坏死因子（TNF—α）和可溶性肿瘤坏死因子受体（sTNFBs）水平及临床意义。方法：采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测105例SLE患者和60例正常对照组血清中TNF—α、sTNFB1、sTNFB2的表达水平。结果：SLE患者血清中TNF—α、sTNFBs水平均高于正常对照组,差异有统计学意义（P〈0．001）。SLEDAI积分提示SLE活动组的患者血清中sTNFR1、sTNFR2表达水平高于SLE非活动组患者（P〈0．001）;抗dsDNA抗体阳性组血清中TNF-α、sTNFRs水平均高于抗dsDNA抗体阴性组（P〈0．01）。SLE患者肾脏受累组中TNF—α、sTNFBs水平均高于非肾脏受累组（P〈0．001）。另外,SLE患者血清中sTNFBs表达水平与TG水平升高存在相关性,相关系数分别为r=0．388、r=0．436（P〈0．01）。结论：sTNFRs与SLE患者血清中TG水平存在正相关,与疾病活动性及肾脏受累亦呈正相关,因此有可能作为判断疾病活动和严重程度的指标。     

腺病毒介导的"睡美人"转座子与IL-10共表达对NOD小鼠Th17/Treg细胞平衡的影响

目的：观察腺病毒介导的"睡美人"（SB）转座子与白细胞介素10（IL-10）共表达对非肥胖糖尿病（NOD）小鼠脾细胞中Th17/Treg细胞平衡的影响,阐明IL-10对NOD小鼠的可能治疗机制。方法：提取C57BL6小鼠的脾细胞并培养,将脾细胞分为对照组、空载体组和治疗组。对照组脾细胞不做任何处理,空载体组将不含IL-10基因而有转座子序列的腺病毒载体和不含转座酶的腺病毒载体共同感染小鼠脾细胞,治疗组将含有IL-10基因和转座子序列的腺病毒载体以及含有转座酶的腺病毒载体共同感染小鼠脾细胞。感染48 h后RT-PCR法检测各组小鼠脾细胞中IL-10 mRNA表达水平。感染48 h后将上述3组处理的脾细胞分别种植到对照组、空载体组和治疗组NOD小鼠右后腿的腘窝皮下,每组6只小鼠,每周注射1次,共6次。注射结束后4周处死小鼠,ELISA法检测各组NOD小鼠血清中IL-10表达水平;流式细胞术检测各组NOD小鼠脾细胞中CD4+IL-10+、CD4+IFN-γ+、Th17和Treg细胞的比例。结果：与对照组和空载体组比较,治疗组C57BL6小鼠脾细胞中IL-10 mRNA表达水平明显升高（F=72.71,P<0.05）,NOD小鼠血清中IL-10表达水平明显升高（F=8.89,P<0.05）,NOD小鼠脾细胞中CD4+IL-10+细胞和Treg细胞比例明显升高（F=72.09,P<0.05;F=12.98,P<0.05）;但治疗组小鼠脾细胞中Th17细胞比例明显下降（F=6.39,P<0.05）;NOD小鼠脾细胞中CD4+IFN-γ+细胞比例在对照组、空载体组和治疗组之间比较差异无统计学意义（F=2.72,P>0.05）。结论：腺病毒介导的SB转座子与IL-10共表达后可以升高NOD小鼠血清中IL-10表达水平;同时可明显升高NOD小鼠脾细胞中CD4+IL-10+细胞比例,降低Th17细胞比例,升高Treg细胞比例,调控Th1/Th2和Th17/Treg的平衡,对NOD小鼠起到治疗作用。     

脂肪间充质干细胞对MRL/lpr小鼠的治疗效果及对脾脏Th17/Treg细胞平衡的影响

目的：探讨移植脂肪间充质干细胞（adipose tissue derived stem cells,ADSCs）对MRL/lpr小鼠的治疗作用及对MRL/lpr小鼠脾脏Th17/Treg细胞平衡的影响。方法：15只12周龄的雌性MRL/lpr小鼠采用随机数字表法分为ADSCs治疗组(ADSCs组)、对照组(control组)和环磷酰胺治疗组（cyclophosphamide,CTX组）,每组5只。ADSCs组经尾静脉注射ADSCs,每次注射的细胞数为1×106/150 μL,每周1次,共注射8次;control组经尾静脉注射等体积磷酸盐缓冲液,每周1次,共注射8次;CTX组经尾静脉注射环磷酰胺,剂量为15 mg/kg（体重）,每周1次,连用2次,休息2周后重复,共注射4次。留取治疗前和治疗后尿液检测24 h尿蛋白浓度。治疗8周后,处死MRL/Ipr小鼠,以流式细胞仪分析脾细胞Th17/Treg细胞比例变化。结果：（1）24 h尿蛋白浓度变化：治疗前,3组小鼠的24 h尿蛋白浓度差异无统计学意义（P>0.05);治疗4周后,ADSCs组和CTX组24 h尿蛋白浓度显著低于control组,差异有统计学意义［(5.02±1.61) g/L vs. (7.10±1.63) g/L、(4.90±0.71) g/L vs. (7.10±1.63) g/L,P<0.05］,而且治疗时间越长,效果越明显,治疗8周后,ADSCs组和CTX组24 h尿蛋白浓度显著低于control组［(2.24±0.73) g/L vs. (10.36±1.64) g/L、(3.80±1.45) g/L vs. (10.36±1.64) g/L,P<0.01］;ADSCs组和CTX组之间24 h尿蛋白浓度差异无统计学意义（P>0.05）。（2）脾脏Treg细胞占CD4+T细胞的百分率：ADSCs组和CTX组脾淋巴细胞中Treg细胞占CD4+T细胞的百分率高于control组,3组分别为13.62%±1.87%、14.14%±1.29%、0.71%±1.23%,但组间差异无统计学意义（P>0.05）。（3）脾脏Th17细胞占CD4+T细胞的百分率：ADSCs组和CTX组脾淋巴细胞中Th17细胞占CD4+T细胞的百分率显著低于control组,3组分别为1.43%±020%、1.63%±0.65%、6.37%±1.64%,差异有统计学意义（P<0.01）。结论：移植ADSCs能够减少MRL/lpr小鼠尿蛋白浓度,治疗时间越长,效果越显著。ADSCs能够降低MRL/lpr小鼠脾脏Th17细胞水平,提高Treg细胞水平,负向调节Th17/Treg细胞平衡,进而发挥抗炎和免疫调节的作用。     

毒蕈碱3型受体胞外区第二环多肽诱导NOD-scid小鼠体内IL-17和IFN-γ的分泌

目的:观察用毒蕈碱3型受体(M3R)胞外区第二环多肽免疫NOD-scid小鼠(nonobese diabetic mice CB17.Prkdcscid/J,非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠)后,小鼠体内IL-17和IFN-γ分泌水平的变化.方法:200 μg的M3R胞外区第二环多肽和不完全弗氏佐剂(IFA)以1∶1的比例配制而成后,皮下免疫NOD-scid小鼠.免疫后1、7、14、21 d尾部采血检测血清中的抗M3R第二环多肽抗体,血清中IL-17和IFN-γ含量的变化,同时测定每星期每只小鼠的饮水量.21 d给予小鼠安乐死,取小鼠脾脏细胞与抗M3R第二环多肽共同培养,观察细胞上清中IL-17和IFN-γ含量的变化.同时取小鼠泪腺做免疫荧光观察IL-17和IFN-γ的变化.结果:用M3R胞外区第二环多肽免疫NOD-scid小鼠14 d后,小鼠体内的抗M3R第二环多肽抗体显著高于对照肽组和PBS组(P＜0.05),血清中IL-17和IFN-γ含量在第14天和第7天显著升高,具有统计学意义(P＜0.01).脾细胞多肽共培养后细胞上清中的IL-17的含量维持在一定的水平,而对照肽组和PBS组则显著下降(P＜0.01).组织免疫荧光显示泪腺中的IL-17和IFN-γ的含量也显著提高.每只小鼠的饮水量3组没有显著差别(P＞0.05).结论:用M3R胞外区第二环多肽免疫NOD-scid小鼠后成功诱导出抗M3R第二环多肽抗体,并且促进了NOD-scid小鼠体内IL-17和IFN-γ的分泌.     

DKK1-siRNA真核表达载体的构建及其对骨质疏松大鼠治疗作用的研究

目的 针对DKK1基因构建两段小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,观察其对骨质疏松（OP）大鼠的治疗作用。方法 12周龄Wistar雌性大鼠随机分为5组,对照组、模型组、空载体组、DKK1-siRNA1组及DKK1-siRNA2组,每组10只。对照组肌注生理盐水,其他组肌注地塞米松造模,连续12w,鉴定骨质疏松模型是否构建成功。构建两段DKK1-siRNA 真核表达载体,尾静脉注射治疗组大鼠,对照组和模型组注射等体积PBS,空载体组注射等体积空载体。骨切片观察载体是否靶向到骨,RT-PCR检测股骨DKK1 mRNA的表达,免疫组化法检测股骨DKK1蛋白的表达水平。 ELISA检测血清中骨碱性磷酸酶（BALP）、Ⅰ型胶原蛋白（Col-Ⅰ）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的水平;测定股骨骨密度及病理结构变化。结果 （1）双酶切和基因测序鉴定结果表明siRNA真核表达载体构建成功;（2）模型组、空载体组及治疗组大鼠造模后,近端股骨骨密度较对照组明显降低（P<0.05）;病理改变为骨小梁数目明显减少、断裂,而对照组骨小梁结构较完整;（3）DKK1-siRNA质粒载体靶向到骨;（4）治疗组大鼠血DKK1-mRNA及股骨DKK1蛋白的表达明显下降;（5）与模型组和空载体组相比,治疗组血清中BALP与Col-Ⅰ水平明显升高, TRAP水平明显下降 (P<0.05);（6）治疗后各组大鼠近端股骨骨密度的差异无统计学意义(P>0.05);（7）治疗组大鼠股骨有新生骨小梁形成,骨小梁破坏减轻。结论 DKK1-siRNA促进骨形成,抑制骨吸收,减轻骨结构的破坏。     

云克治疗糖皮质激素性骨质疏松模型大鼠的实验研究

目的 探讨云克对地塞米松诱导的骨质疏松症大鼠的治疗作用.方法 12周龄的雌性Wistar大鼠30只,随机分为3组,对照组、模型组和治疗组,每组10只.模型组和治疗组给予5mg/kg地塞米松肌注,1次/周,连续注射12周,对照组肌注等剂量的生理盐水.DEXA骨密度仪检测大鼠股骨骨密度,各组均取2只处死,HE染色观察股骨结构的病理改变鉴定骨质疏松大鼠模型是否构建成功.骨质疏松模型构建成功后,治疗组大鼠尾静脉注射云克(0.05 μg/kg),对照组和模型组注射等剂量的生理盐水,1次/周,连续注射15周,治疗前后尾静脉采血,ELISA法检测血清骨碱性磷酸酶和酒石酸酸性磷酸酶水平的变化.检测各组大鼠治疗后的股骨骨密度,之后,处死各组大鼠,取股骨,免疫组化法检测大鼠股骨骨保护素的变化,HE染色观察骨结构的病理改变.结果 (1)模型组和治疗组大鼠经地塞米松处理12周后,股骨骨密度较对照组明显降低(P＜0.05);病理改变为骨小梁稀疏、数目明显减少甚至断裂,而对照组骨小梁结构较完整.(2)与模型组相比,治疗组大鼠血清骨特异碱性磷酸酶水平明显升高(P＜0.05),而抗酒石酸酸性磷酸酶水平有所下降,但无统计学差异(P＞0.05).(3)治疗组治疗后血清骨特异碱性磷酸酶水平明显升高(P＜0.05),而抗酒石酸酸性磷酸酶水平有所下降,但无统计学差异(P＞0.05).(4)与模型组和治疗前相比,治疗组大鼠股骨骨密度无明显改变(P＞0.05).(5)与模型组相比,治疗组大鼠股骨骨保护素表达明显增加.(6)云克治疗后,治疗组大鼠股骨有新生骨小梁的广泛形成,骨小梁结构破坏较模型组明显减轻.结论 云克对糖皮质激素性骨质疏松大鼠有治疗作用.