雌二醇与ESR1靶向结合通过ERK信号通路调控软骨细胞的增殖

目的探讨雌二醇（E2）/ESR1（ERα）对C28I2软骨细胞增殖的影响及可能的分子机制。方法应用Ad-Easy 腺病毒包装系 统构建和包装过表达腺病毒Ad-ESR1,Western blot及QPCR检测该基因在细胞中蛋白及RNA表达情况。在E2处理下,设立不 同病毒感染组处理C28I2细胞,Western blot 检测各处理组C28I2细胞的自噬、凋亡相关蛋白的表达及ERK信号通路的磷酸化 水平;免疫荧光实验观察细胞内自噬流的强弱;FCM检测各组细胞凋亡率及周期;QPCR检测mRNA水平增殖相关标志基因 （PCNA）、细胞周期蛋白B1（CyclinB1）和细胞周期蛋白D1（CyclinD1）表达。ERK特异性抑制剂处理细胞,Western blot检测抑 制ERK通路后自噬及凋亡相关蛋白表达,QPCR检测增殖相关标志基因表达。结果成功构建过表达腺病毒Ad-ESR1。过表达 ESR1 能够促进E2 处理后LC3 和ATG7 的表达,促进LC3 和LAMP1 在细胞质中共定位,抑制cleaved caspase3、cleaved caspase12的表达并且促进PCNA、cyclinB1和cyclinD1表达,且细胞内pERK明显减少;而干扰ESR1表达后,自噬相关蛋白表 达减少,自噬流减弱,凋亡蛋白表达增加,增殖标志基因表达下调,细胞内pERK相对增加。特异性抑制剂阻断ERK活化,E2/ ESR1诱导的自噬增加以及凋亡减少被抑制,增殖相关基因表达被抑制。结论E2与ESR1的靶向结合可促进软骨细胞的增殖, 其作用机制可能与抑制ERK信号通路活化从而促进自噬、抑制凋亡有关。     

IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白降低软骨细胞的自噬功能

目的 探究肌醇依赖性激酶1α（IRE1α）通过调控内质网钙稳态蛋白（CHERP）影响软骨细胞自噬功能的相关机制。方法 衣霉素（TM）处理人软骨细胞C28/I2,Western blot检测不同时间点的内质网应激和自噬相关蛋白指标。4μ8c、雷帕霉素（Rapa）处理C28/I2（分为：NC组、4μ8c组、Rapa组、4μ8c+Rapa组）,Western blot检测自噬相关蛋白指标。分别从软骨组织特异性ERN1基因敲除小鼠（ERN1 CKO）和对照小鼠（Control）软骨组织分离原代软骨细胞,qPCR检测ERN1及自噬相关蛋白ATG5、ATG7的mRNA 水平,Western blot 检测 IRE1α/p- IRE1α、CHERP 表达水平,流式细胞术检测胞内钙离子含量。巴佛洛霉素 A1 （Bafilomycin A1）处理原代软骨细胞（分为Control组、Control+Bafilomycin A1组、ERN1 CKO组、ERN1 CKO+Bafilomycin A1 组）,Western blot检测LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的表达。自噬双荧光病毒在Rapa处理下检测自噬流（分为Control+Rapa组、ERN1 CKO+Rapa组）。C28/I2中过表达CHERP与IRE1α,免疫荧光检测自噬水平。结果 TM处理C28/I2细胞后,内质网应激相关标志蛋白表达上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.05）,p62表达下调（P<0.05）。相较对照组,Rapa上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值（P<0.001）,4μ8c+Rapa组相较Rapa组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低（P<0.05）。相较于对照组,原代软骨细胞中敲除ERN1/IRE1α后,ERN1（P<0.01）、ATG5（P<0.001）、ATG7（P<0.001）mRNA水平显著下调。IRE1α/p-IRE1α蛋白表达缺失或显著下调（P<0.01）,CHERP蛋白表达上调（P<0.05）,胞内钙离子含量显著上升（P<0.001）。巴佛洛霉素 A1 处理原代软骨细胞后,Control+Bafilomycin A1 组较Control组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.01）,ERN1 CKO+Bafilomycin A1组较ERN1 CKO组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.05）、较Control+Bafilomycin A1组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降（P<0.05）。自噬双荧光病毒处理后,ERN1 CKO+Rapa组较Control+Rapa组未淬灭LC3-GFP荧光增强（P<0.05）。C28/I2细胞中过表达CHERP降低LC3荧光强度,过表达IRE1α增强LC3荧光表达并能部分挽救CHERP导致的荧光降低情况。结论 IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白,升高胞内钙离子含量,进一步导致软骨细胞的自噬功能受损。     

雌二醇通过ERβ调控ERK磷酸化影响细胞增殖和凋亡

目的 探究雌二醇（E2）结合其重组人雌激素受体β（ESR2）对C28I2细胞增殖和凋亡的效应。方法 PCR扩增ESR2序列并构建腺病毒重组质粒pAd-ESR2,在HEK293细胞中包装重组腺病毒Ad-ESR2。用Ad-ESR2和ESR2-siRNA处理人正常软骨细胞C28I2,分别设置对照组（C28I2+DMSO）、E2组（C28I2+E2）、Ad-ESR2组（C28I2+DMSO+ Ad-ESR2）、E2+Ad-GFP组（C28I2+ E2+Ad-GFP）、E2+Ad-ESR2组（C28I2+E2+Ad-ESR2）、E2+sicontrol组（C28I2转染sicontrol+E2）、E2+ESR2-si1组（C28I2转染ESR2-si1+E2）、E2+ESR2-si3组（C28I2转染ESR2-si3+E2）。免疫印迹测定ER Stress和细胞凋亡相关蛋白表达,qRT-PCR检测增殖相关标志基因的表达,借助EdU试剂盒和流式细胞术测定细胞增殖和凋亡情况。使用ERK通路抑制剂U0126分别设定E2 组、E2+U0126组（C28I2+E2+U0126）、E2+Ad-ESR2组、E2+Ad-ESR2+U0126组（C28I2+E2+Ad-ESR2+U0126）。通过免疫印迹实验探究C28I2细胞中E2通过ERβ调控ERK信号通路影响ER stress和凋亡。结果 成功构建过表达腺病毒Ad-ESR2和靶向ESR2的siRNA;过表达Ad-ESR2能够促进E2处理后IRE1α[1.20±0.06 vs 0.95±0.05,P<0.05]、PERK[1.29±0.04 vs 1.03±0.02,P< 0.05]和XBP1s[1.17±0.03 vs 0.82±0.02,P<0.05]的表达,促进凋亡Cleaved Caspase12（P<0.05）、抑制增殖相关标志基因PCNA（P<0.05）、CyclinB1（P<0.05）、CyclinD1（P<0.05）的表达,且ERK磷酸化激活降低（P<0.05）;转染ESR2-siRNA后,细胞的内质网应激相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的表达降低,与细胞增殖相关的基因被上调,且细胞内pERK/ERK比值相对增加。经特异性ERK通路抑制剂U0126处理后,雌二醇结合ERβ促进的内质网应激蛋白及细胞凋亡蛋白的表达被拮抗。结论 雌二醇靶向ERβ通过激活ERK通路磷酸化调控内质网应激及凋亡,进而抑制软骨细胞增殖。