慢病毒载体介导的 RNA干扰对 HDAC2基因表达的影响

目的：构建组蛋白去乙酰化酶2（ HDAC2）基因的慢病毒表达载体,研究HDAC2基因在肝癌HepG2细胞中的表达。方法：将前期构建并鉴定正确的3条重组表达质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 1组、2组、3组及1条阴性对照pLKO.1-HDAC2-shRNAneg和空载体对照pLKO.1,运用脂质体法分别与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2. G共同转染人胚肾细胞293T,制备具有感染能力慢病毒颗粒;收集、纯化含病毒颗粒的上清液并感染人肝癌HepG2细胞,设未处理HepG2细胞为空白对照,采用Real time PCR 和Western blotting检测感染48 h和72 h后HepG2细胞中HDAC2基因mRNA和蛋白表达水平,鉴定、分析重组质粒的干扰效果。结果：与空白对照组相比,3条干扰序列转染肝癌HepG2细胞后均能明显抑制HDAC2 mRNA的表达（ P＜0.05）,其中以pLKO.1-HDAC2-shRNA 1组的抑制率更明显,达到82.09％;3条干扰序列均能明显抑制HDAC2蛋白的表达（ P＜0.05）,以pLKO.1-HDAC2-shRNA 1组和3组的干扰效果最明显,但两者相比较差异无统计学意义（ P＞0.05）。结论：构建的重组质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA能从转录水平和蛋白水平有效抑制HDAC2基因在HepG2细胞中表达。     

HDAC2基因RNA干扰载体的构建

目的:构建组蛋白去乙酰化酶2 (HDAC2)基因RNA慢病毒干扰质粒载体.方法:对比HDAC2基因序列,设计并合成短发夹RNA(shRNA)干扰靶点序列,克隆入经AgeI与EcoRI双酶切后的RNA干扰载体pLKO.1-puro,构建pLKO.1-HDAC2-shRNA重组质粒,采用酶切法和测序法验证重组质粒.结果:成功退火合成3对短发夹RNA序列并将其克隆入pLKO.1-puro载体中,构建重组质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA1、pLKO.1-HDAC2-shRNA2及pLKO.1-HDAC2-shRNA3,经酶切鉴定和测序验证重组质粒载体与预期靶序列相同.结论:成功构建HDAC2-shRNA慢病毒干扰载体,为进一步研究HDAC2的功能及应用提供有效工具.     

吴茱萸碱对人肝癌HepG2细胞增殖影响

目的 探讨吴茱萸碱(EVO)对人肝癌HepG2细胞增殖的影响及作用机制.方法 以人肝癌细胞株(HepG2细胞)为受试细胞,实验设对照组、吴茱萸碱5.0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L组,采用噻唑蓝法检测HepG2细胞增殖抑制率,划痕实验检测HepG2细胞伤痕愈合率,Western blot检测HepG2细胞基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白.结果 吴茱萸碱对HepG2细胞增殖抑制率明显高于对照组,呈现时间-剂量依赖关系(P＜0.05);与对照组比较,吴茱萸碱5.0、25.0、50.0 μmol/L组HepG2细胞24、48 h伤痕愈合率[分别为(23.31 ±1.03)％、(10.37±1.06)％、(7.92±1.40)％和(13.86±5.57)％、(1.78±3.08)％、0％]明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05);与对照组比较,吴茱萸碱5.0、25.0、50.0 μmol/L组HepG2细胞24 h MMP-9、PCNA蛋白表达量[分别为(0.53±0.020)、(0.35±0.020)、(0.21 ±0.015)与(0.76±0.032)、(0.66±0.01)、(0.59±0.015)]降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 吴茱萸碱可明显抑制HepG2细胞增殖及远处迁徙,其机制可能与吴茱萸碱下调MMP-9、PCNA蛋白有关.     

门诊血常规标本TAT时间监测及改进

目的探讨门诊血常规标本周转时间(TAT)的实时监控与持续改进措施。方法对贵州省人民医院检验科血液组在工作流程实施改进措施前2017年9-11月的门诊血常规标本TAT进行实时监控与统计分析,2017年11月份后通过优化标本流通环节、人员定岗,提升检测效率,并观察实施改进措施后2017年12月至2018年2月的门诊血常规标本TAT的实时监控与统计分析,着重分析实验室内各时间段的TAT,观察TAT在采取改进措施后的变化。结果实施改进措施后,TAT逐渐缩短。结论通过TAT实时监控分析与改进措施,优化标本运输流程,提升检验科服务能力,对门诊标本采集、送检等流程的管理和改善实验室内检测效率等手段,是缩短TAT的关键。     

吴茱萸碱对肝癌HepG2细胞侵袭和迁徙的影响

目的:研究吴茱萸碱对人肝癌细胞Hep G2细胞外调节蛋白激酶(extracellular-regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)表达的影响.方法:Transwell小室检测吴茱萸碱对Hep G2细胞侵袭及迁徙的影响.集落形成实验检测吴茱萸碱对Hep G2细胞集落形成能力的影响.Western blot检测Hep G2细胞ERK1/2、phospho-ERK1/2(P-ERK1/2)蛋白.结果:吴茱萸碱5、25、50μmol/L作用后,H e p G 2细胞侵袭细胞数分别为3 2.3个±1.3个、22.3个±2.5个、10.6个±3.7个,对照组为97.6个±6.3个,差异有统计学意义(P<0.05);迁徙细胞数为57.7个±3.2个、26.8个±1.6个、15.4个±3.9个,对照组为106.3个±3.2个,差异有统计学意义(P<0.05).5、25、50μmol/L吴茱萸碱作用Hep G2细胞集落形成数分别为147.0个±12.1个、94.3个±4.0个、0个,对照组为231.3个±15.4个,差异有统计学意义(P<0.05).Western blot分析5、25、50μmol/L吴茱萸碱处理Hep G2细胞24 h及30μmol/L吴茱萸碱处理Hep G2细胞24、48 h后,ERK1/2蛋白的表达无明显变化,但其活化形式P-ERK1/2蛋白的表达量减少.结论:吴茱萸碱可显著抑制人肝癌Hep G2细胞侵袭和迁徙及克隆增殖能力,其机制可能与吴茱萸碱抑制ERK1/2蛋白活化有关.