异烟肼、利福平治疗肺结核致肝毒性易感基因的研究

目的：探讨N-乙酰基转移酶(NAT2)基因型与异烟肼、利福平治疗肺结核致肝毒性的相关性。方法：通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)技术分析67例经利福平、异烟肼治疗后发生或未发生肝功能异常的肺结核患者NAT2基因多态性的部位、性质及发生率。结果：病例组和对照组857位密码子多态性分别是20．3％和7．1％，两组差异显著。结论：NAT2基因型与异烟肼和利福平所致肝毒性关系密切，其中857位密码子点突变可能是结核患者发生肝毒性的易感基因型之一。     

结核分支杆菌Ag85B蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的：通过结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的表达，获得大量纯化的重组Ag85B(rAg85B)蛋白。方法:应用PCR技术扩增结核分支杆菌H37RvAg85B DNA序列；以质粒pET24b为表达载体，构建Ag85B重组质粒，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)；以IPTG诱导转化子，通过SDS—PAGE电泳鉴定rAg85B的表达水平，采用Novagen公司生产的His．Bind蛋白纯化试剂盒纯化rAg85B蛋白。结果:重组质粒PET24b—Ag85B测序表明与报道的序列相同；它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的30％左右。纯化后的rAg85B样品经SDS—PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为95％左右，每100ml培养菌可获得10mg左右纯化的重组蛋白。结论:pET24b—Ag85B大肠杆菌工程菌株能高效表达rAg85B蛋白，大量纯化的rAg85B为其进一步的研究与应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌保护性抗原的研究进展

结核分枝杆菌（MTB）蛋白根据蛋白分布的位置可分为分泌蛋白、胞质蛋白和膜蛋白。分泌蛋白是MTB在早、中期分泌释放于菌体外的一组蛋白，游离于培养基中或在感染细胞的吞噬小体内，在菌体内仅有微量存在；而胞质蛋白主要存在于细菌的细胞质中，在细菌对数生长的晚期细菌死亡后才释放到培养基中。将培养不超过5d的滤液蛋白称为短期培养滤液蛋白，这是记忆性免疫CD4^＋T淋巴细胞的靶分子；将培养7d以上的滤液蛋白称为长期培养滤液蛋白，随着培养时间的延长，滤液中蛋白越来越多，由于部分MTB开始裂解死亡，释放胞质蛋白，培养42d时滤液中已有100多种蛋白质。结核病保护性免疫主要是细胞免疫，诱导细胞免疫反应的抗原主要存在于细胞壁、细胞质和培养滤液中，其中分泌蛋白和细胞壁表面的蛋白是主要的免疫保护性抗原，将成为新疫苗研究的首选靶抗原。现将保护性抗原的编码基因、生物学特性、免疫学功能等介绍如下。     

人型结核杆菌克隆DNA探针的制备及其应用的研究

用限制性内切酶ＰｓｔⅠ消化人型结核杆菌Ｈ３７ＲｖＤＮＡ,与质粒ｐＵＣ１９ ＤＮＡ连接后转化大肠杆菌,经同位素３２Ｐ标记的人型结核杆菌Ｈ３７Ｒｖ全染色体ＤＮＡ探针筛选出６个阳性克隆（ＭＴ１￣６）,其中克隆ＤＮＡ片段ＭＴ２（４．２Ｋｂ）、ＭＴ４（３．５Ｋｂ）和ＭＴ５（３．０Ｋｂ）标记成探针,检测了２２种分支杆菌标准株和１５侏人型结核杆菌临床分离侏以及２种非分支杆菌,其杂交结果完全相同,与人型结核杆菌及     

复合PCR-膜芯片技术对结核分枝杆菌链霉素耐药性的快速检测

目的　应用复合聚合酶链反应 (复合 PCR) -膜芯片技术快速检测结核分枝杆菌对链霉素 ( SM)的耐药性。方法　设计与合成用于检测结核分枝杆菌耐 SM基因 rps L和 rrs的寡核苷酸探针制作膜芯片 ,与结核分枝杆菌分离株生物素标记的 rps L和 rrs基因复合 PCR产物进行反向斑点杂交 ,并与 PCR-单链构象多态性 ( PCR- SSCP)和 PCR-直接测序 ( PCR- DS)结果比较。结果　 5 2株结核分枝杆菌临床分离株中 ,9株敏感株rps L和 rrs基因的 SSCP图谱、膜芯片杂交结果与标准株完全相同 ;4 3株耐 SM菌株中 ,33株存在 rps L 基因4 3位密码子 AAG→ AGG突变 ,5株有 rrs基因 5 13位 A→C突变 ,1株有 rrs基因 5 13位 A→ T突变 ,突变率为 90 .7%。结论　膜芯片技术检测结核分枝杆菌耐 SM基因型灵敏度高、特异性强、简便、快速 ,可用于临床耐药性检测     

结核病临床分离株及痰标本中embB基因型的快速测定

目的建立快速测定结核病耐乙胺丁醇(EMB)分离株和痰标本中结核分枝杆菌EMB耐药基因型的方法，以期为患者提供及时、有效地化验结果。方法应用16S rDNA聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性(SSCP)和PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)对11株耐EMB分离株和46例结核病痰标本进行分子菌种鉴定和embB基因突变的部位与性质分析。结果以结核分枝杆菌H37Rv标准株为对照，11株耐EMB分离株和46例临床痰标本经16S rDNA PCR-SSCP分析电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同；限制性内切酶NlaⅢ消化embB基因扩增产物显示，11株耐EMB分离株中4株(36．4％)不被NlaⅡ消化；46例结核病痰标本中10例(21．7％)不被NlaⅡ消化。结论部分结核分枝杆菌耐EMB是由于embB基因突变所致。采用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法可直接快速测定结核病耐EMB分离株和痰标本中结核分枝杆菌耐EMB基因型。     

应用PCR-反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌耐链霉素基因型

目的 应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌对链霉素(SM)的耐药性。方法 设计与合成用于检测结核分枝杆菌耐SM基因rpsL和ms的寡核苷酸探针，点于硝酸纤维素膜上，与结核分枝杆菌分离株生物素标记的聚合酶链反应(PCR)产物进行反向斑点杂交，并与PCR-单链构象多态性(PCR—SSCP)和PCR-直接测序(PCR-DS)结果比较。结果 53株结核分枝杆菌临床分离株中，三种检测方法符合率为100％。9株敏感株rpsL和ms基因的SSCP图谱、膜杂交结果与标准株完全相同；44株耐SM菌株中，33株存在rpsL基因43位密码子AAG→AGG突变，6株有ms基因513位A→C突变，1株有ms基因513住A→T突变，突变检出率为90．9％，40株耐SM菌株和9株敏感株可用膜杂交方法检测出来，与传统药敏试验方法检测符合率为49／53。结论 应用膜反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐SM基因型灵敏度高、特异性好、简便、快速，可用于临床耐药性检测。     

用耐药基因检测方法指导老年肺结核病人治疗的临床研究

目的：了解老年肺结核病人的结核分支杆菌耐药情况，评价它们的临床应用价值。方法：采用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）检测结核分支杆菌rpoB,katG,rpsL,pncA,embB基因突变和药物敏感试验（比例法），了解117例老年结核病人结核分枝杆菌耐药情况。探讨和比较2种耐药性检测方法的检测效果。结果：1／2上的肺结核病人至少耐2种抗结核药物，对RFP、INH、SM、PZA和EB总耐药率为82．1％、71．7％、63．2％、51．2％和35．0％，耐多药率为67．5％，rpoB,katG,rpsL,PpncA和embB基因突变率分别为72．8％、64．9％、59．8％、41．0％和30．7％，多基因突变株达76．0％，结核杆菌耐药基因突变与耐药水平联系密切，多数结核分支杆菌耐药基因突变易发生在高耐药区，也有少数基因突变发生在低耐药区。根据药敏试验和耐药基因检测，耐多药结核病人6个月治愈率分别达到54．8％和62．8％，治疗效果满意，两种方法没有显著性差异（P＞0．05）。结论：耐药基因检测指寻治疗是一种新探索，PCR－SSCP方法敏感，特异，可以快速检测结核菌rpoB,katG,rpsL,pncA和embB耐药基因突变，可能会成为临床指导用药的好方法。     

母牛分支杆菌制剂对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮水平的影响

一氧化氮（ＮＯ）在活化巨噬细胞抗某些肿瘤细胞和微生物上起重要作用。用不同剂量的母牛分支杆菌制剂免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，检测小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮的水平，结果显示受免疫小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮水平明显高于未免疫小鼠（Ｐ＜０．０１－０．００１）。不同剂量母牛分支杆菌制剂免疫的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，腹腔巨噬细胞产生的一氧化氮水平差别不显著（Ｐ＞０．０５）。因此认为，母牛分支杆菌制剂作为结核病免疫治疗剂其作用之一是活化巨噬细胞产生一氧化氮，从而达到杀菌的目的。     

牛贝消核提取物血清药物化学的初步研究

目的: 对抗结核中药牛贝消核提取物进行血清药物化学初步研究,通过分析入血成分,探讨牛贝消核发挥药效的物质基础。方法: 2018年4月至2019年6月在中国人民解放军总医院第八医学中心全军结核病研究所制备桔梗、白及、鱼腥草和牛蒡子标准品溶液及牛贝消核供试品;55只小鼠随机分为11组,每组5只:1~5组为牛贝消核提取物组,每只小鼠每天给予 1.25mg/g牛贝消核提取物灌胃;6~10组为牛蒡苷组,每只小鼠每天给予 0.3mg/g牛蒡苷灌胃;11组为空白对照组,给予蒸馏水灌胃;连续灌胃7d。于末次给药后0.5、1、2、4、6h小鼠眼眶后静脉丛取血,制备血清供试品溶液。采用高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography, HPLC)分析各中药标准品、牛贝消核提取物供试品及各组小鼠给药后血清供试品溶液,分析色谱图中各物质保留时间;然后参照对照品初步鉴定牛贝消核提取物的入血成分。结果: 通过牛贝消核提取物和各药材标准品重叠色谱图中可以看出,牛贝消核提取物保留时间为7.1min处的色谱峰所对应的物质来源于桔梗,保留时间为13.5min、15.5min、21.2min处的色谱峰所对应的物质来源于白及,保留时间为16.3min的色谱峰所对应的物质来源于牛蒡子,并进一步鉴定为牛蒡苷化合物。牛贝消核提取物和牛蒡苷给药后血清样本与空白血清比较,均在17.5~22.5min发现有吸收峰。结论: HPLC分析可作为牛贝消核中桔梗、白及、鱼腥草和牛蒡子提取的质量控制方法,检出的牛贝消核提取物血中移行成分可能是牛蒡苷代谢产物,其余药效成分入血微量未检出。