卡介苗作为抗肿瘤重组蛋白疫苗佐剂的研究

目的：探讨卡介苗（BCG）能否增强抗肿瘤疫苗HSP-MUC1的特异性抑瘤作用，从而将BCG开发为肿瘤疫苗的新型佐剂。方法：动物水平上，BCG和HSP-MUC1共免疫小鼠，观察BCG能否增强HSP-MUC1所激发的特异性抑瘤作用。细胞水平上对BCG发挥佐剂作用的机制进行探讨，将BCG和HSP-MUC1共刺激树突状细胞（DC），观察BCG能否协同HSP-MUC1刺激DC表面的CD86分子表达的上调；并对DC培养上清中IL-6、TNF-α的水平进行测定。结果：BCG＋HSP-MUC1组小鼠的肿瘤重量显著地低于HSP-MUC1组（P〈0.05）。细胞学试验显示，BCG能够显著增强HSP-MUC1对DC的激活作用，使DC表面的CD86分子显著上调。BCG＋HSP-MUC1组的DC培养上清中细胞因子IL-6、TNF-α的水平显著地高于HSP-MUC1组（P〈0.05）。结论：BCG能够显著地增强HSP-MUC1的抗肿瘤活性，具有肿瘤疫苗佐剂的良好功效。     

建立一种用重组蛋白检测抗口蹄疫病毒抗体的间接ELISA方法

目的研究以重组蛋白作为包被抗原检测口蹄疫病毒（FMDV）感染后的动物血清中特异性抗体的可能性,为建立一种非病毒颗粒的ELISA检测试剂盒提供实验依据。方法利用自行构建表达的O型口蹄疫病毒VP1表位肽重组蛋白（VP1epi）作为包被抗原,采用间接ELISA方法确定抗原的最佳工作浓度和包被方法,优化各项实验条件,并以FMDV感染后的豚鼠血清作为标准阳性血清确定ELISA方法的特异性和灵敏度。结果FMDV感染后的阳性豚鼠血清可以很好地识别VP1epi重组蛋白,用此蛋白包被检测抗FMDV抗体的灵敏度可达1∶3200,并证明所检测的抗体是FMDV特异性的。结论VP1epi重组蛋白可以替代FMDV颗粒用于建立检测抗FMDV抗体的ELISA试剂盒。     

Hsp65与HBV多表位融合基因的表达及其免疫应答研究

目的 用基因工程的方法构建并表达一种由 Hsp65、通用辅助T细胞表位(PADRE)和HBV表面抗原与核心抗原的多个表位组成的乙型肝炎治疗性疫苗(简称为Hsp65-HBV).方法 采用PCR方法人工合成由PADRE和HBV的多个表位组成的基因片段,将此片段克隆入原核表达质粒pET28a/Hsp65后.利用大肠杆菌进行融合蛋白的表达.用纯化后的蛋白免疫nalb/c 小鼠.将小鼠脾细胞用HBsAg 装载的P815细胞在体外刺激5 d后,用流式细胞仪检测IFN-γ 细胞的频率.用ELISA方法检测小鼠血清中的特异性抗体(IgG1和IgG2a)的产生.结果 由Hsp65、通用辅助T细胞表位(PADRE)和HBV的多个表位组成的融合蛋白能在大肠杆菌中进行高水平的表达,能诱导小鼠产生IgG2a亚型的特异性抗体,并能诱导 HBV 特异性的 IFN-γ 的淋巴细胞的产生.结论 获得了大肠杆菌表达的由Hsp65、通用辅助T细胞表位(PADRE)和HBV的多个表位组成的融合蛋白,并能被机体以MHC-Ⅰ途径递呈,为检测本融合蛋白是否能激发出HBV特异性CTL反应奠定了基础.     

卡介苗热休克蛋白70对肿瘤细胞裂解物免疫原性的影响

的：观察卡介苗热休克蛋白70（BCGHSP70）对肿瘤细胞裂解物（TCL）免疫原性的影响,为TCL相关肿瘤疫苗的制备提供依据。方法：应用冻融法制备B16黑色素瘤细胞裂解物B16TCL,将BCGHSP70与B16TCL在体外混合制备BCGHSP70-B16TCL。将C57BL/6小鼠随机分为BCGHSP70-B16TCL组、PBS组、BCGHSP70组和B16TCL组,分别于第1和14天皮下免疫BCGHSP70-B16TCL、PBS、BCGHSP70和B16TCL。于末次免疫后第7天处死小鼠,MTT法观察不同免疫组小鼠脾淋巴细胞在B16TCL体外刺激后的增殖情况,计算刺激指数（SI）。结果：应用冻融法能够使B16细胞完全裂解,所制备的B16TCL中含有丰富的蛋白成分。与PBS组、BCGHSP70组和B16TCL组比较,BCGHSP70-B16TCL组免疫小鼠脾脏明显增大;BCGHSP70-B16TCL免疫组SI高于PBS免疫组（P=0.00）、 B16TCL免疫组（P=0.01）和BCGHSP70免疫组（P=0.00）。结论：BCGHSP70　能够增强B16TCL的免疫原性,提示BCGHSP70可能作为有效的免疫佐剂用于TCL相关肿瘤疫苗的研究。     

抗O型口蹄疫病毒VP1单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备抗O型口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白VP1的单克隆抗体（mAb）并进行特性鉴定。方法：以自行构建表达的O型FMDV—VP1表位重组蛋白（VP1epi）为抗原免疫BALB／c小鼠，按常规方法进行细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株，用Western blot、间接ELISA和斑点免疫测定法对mAb的特异性进行鉴定。结果：成功地获得1株分泌抗VPlepi重组蛋白mAb的杂交瘤细胞株“C7”，其分泌的mAb为IgG1亚类，能特异性地识别VP1epi重组蛋白，其腹水效价可达1：12800。斑点免疫测定法显示，该mAb能很好地识别灭活的FMDV。结论：VP1epi重组蛋白可代替FMDV制备抗天然FMDV—VP1的mAb。抗O型FMDV—VP1 mAb的成功制备，为进一步研究开发新型FMDV的检测方法奠定了基础。     

HIV-1 Tat基因的融合构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的：在E．coli BL21(DE3)中高效表达Tat蛋白。方法：用PCR方法构建HIV-1 Tat基因全序列，同时将Tat基因进行定点突变(AAG28替换为CAG，AAG50替换为CAG)，以消除天然．Tat蛋白的转录活性。将突变的Tat基因与伴侣10(chap10)基因连接后，共同亚克隆人表达载体pET28a中，并在Ecoli中表达，表达产物用Western blot进行鉴定。结果：分别通过3轮PCR，成功地构建了Tat基因全序列。构建的重组质粒pET28a-chap10-Tat在Ecoli BL21(DE3)中得到高效表达。Western blot分析表明，在相对分子质量(Mr)为24000处有1条特异性的带。结论：chap10基因与HIV-1 Tat全基因的融合构建，使Tat蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，为其在爱滋病发病中作用研究奠定了基础。     

双阳型梅花鹿脾脏细胞cDNA文库的构建和四个EST的发现

目的：开发和利用中国梅花鹿的基因资源,以期拥有一批梅花鹿基因的专利,并在专利保护下生产具有自己知识产权的基因工程药物。方法：用Trizol试剂提取梅花鹿脾脏细胞中的总RNA,分离得到mRNA后,用逆转录方法合成与mRNA互补的cDNA单链,再以此cDNA单链为模板,得到与该cDNA互补的另一条DNA链,将得到的DNA双链分子通过合适的Adapter连入pSPORT1质粒,将此重组质粒通过电转化方法导入E.coli DH5α菌,得到脾脏细胞的cDNA文库。筛选出阳性重组子,测序并分析得到的ESTS序列。结果：成功地构建了双阳型梅花鹿脾脏细胞cDNA文库;并对部分库容cDNA进行了克隆和测序,在这一过程中发现4个与已知基因同源的表达序列标签(ESTS),其中2个EST分别是梅花鹿视网膜母细胞瘤的同源基因和梅花鹿维生素K依赖性蛋白前体cDNA的部分序列。结论：通过构建cDNA文库的方法成功地得到了一批有价值的梅花鹿的基因片段。     

卡介苗HSP70的表达、纯化及活性检测

目的:在大肠杆菌中表达并纯化出具有良好生物学活性的卡介苗HSP70(BCG HSP70)蛋白.方法:利用PCR技术扩增出BCG HSP70的编码基因,将其克隆到pMD18-T载体,测序分析.再将该目的基因亚克隆至pET28a表达载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3),获得正确的阳性克隆子后,用IPTG诱导表达.纯化表达产物,SDS-PAGE及Western blot鉴定目的蛋白,并通过脾增生实验检测其生物学活性.结果:扩增的BCG HSP70基因经序列测定与GenBank公布的序列完全一致.表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量(Mr)约70 000处有表达条带.Western blot结果证实纯化产物在Mr约70 000处可见特异性条带.蛋白纯度约96.5%.脾细胞增生试验显示,该蛋白能够明显刺激鼠脾细胞增殖.结论:成功表达并纯化了具有良好生物学活性的BCG HSP70,为进一步研究BCG HSP70及BCG的功能奠定了基础.     

外周血CK-20基因表达与大肠癌微转移关系的研究

目的:探讨靶基因CK-20在直肠癌患者外周血中的表达及与肿瘤微转移的关系。方法:应用套式RT-PCR方法检测10例健康成人,17例非恶性消化系统疾病患者,32例大肠癌患者外周血中的肿瘤细胞。结果:①正常对照组及非大肠癌对照组均未检出CK-20mRNA阳性细胞;②大肠癌组中,2例A期患者CK-20mRNA均呈阴性,15例B期患者中阳性4例;10例C期患者中阳性6例;5例D期患者中阳性4例;③在32例大肠癌患者中CK-20mRNA阳性总检出率为43.8%;A、B期阳性率为23.5%;C、D期阳性率为66.7%。结论:应用RT-PCR法检测外周血瘤细胞的CK-20靶基因对大肠癌具有特异、敏感、无损伤等特点,它可能有助于肿瘤经血液微转移的早期诊断以及指导化疗。     

对从文库中钓取的未知序列进行初步分析的方法

从文库中钓取特定基因时 ,常常会克隆到一些未知的ＤＮＡ序列。这些序列很可能是未知蛋白质的编码基因 ,因此 ,对这些基因的分析很可能是发现某些新蛋白质的契机。本文作者在从人胚胎脑组织ｃＤＮＡ文库中钓取ＦＧＦ 1 7的过程中 ,利用ＦＧＦ 1 7的引物 ,经ＲＴ ＰＣＲ获得了一