SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR测定猴免疫缺陷病毒RNA拷贝数方法的建立

.学者论坛·在动物实验中解决临床难题···························，·······································································……顾玉东(3)基因〕:程     

重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂预防治疗恒河猴感染SARS-CoV的试验研究

目的评价重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂对恒河猴感染SARS-CoV的预防治疗作用。方法采用鼻腔喷雾法(剂量为60万单位/鼻孔)研究了重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂对感染SARS-CoV的恒河猴预防治疗效果。结果试验组(5只)和对照组(5只)相同时间检测的咽拭子等标本中,Real-time PCR检测和病毒分离均未检出病毒。攻毒后病毒导致机体产生的中和抗体和IgG抗体的反应也较对照组弱。血液学指标检测结果表明试验组动物攻毒后各项指标较试验前比较没有显著性改变;病理结果显示试验组2只恒河猴肺组织形态基本正常,其余3只猴有肺间质性炎,表现肺间隔增厚、单核样细胞为主的炎细胞浸润,其中1只增厚的肺间隔有局灶相互融合,这3只猴肺部病变与对照组的病变表现相似,且病变累及范围较对照组小;其他各受检脏器均未见明显异常。结论重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂可以有效阻断或减弱SARS-CoV对恒河猴的感染。     

急性SIVmac感染猴模型评价中药1号体内抗病毒效果

采用ＳＩＶｍａｃ感染剂量（１～１０ＭＩＤ５０）和先给药后感染方式，中药Ⅰ号能１００％保护动物不发生活动性ＳＩＶ感染，表现在感染治疗后从血浆分离病毒阴性，无可检出的抗体，ＰＣＲ检测ＰＢＭＣＳＩＶｍａｃＤＮＡ阴性，但巢式—ＰＣＲ检测２／３猴阳性。对照组３／４猴建立了真正感染，病毒分离阳性，抗体上升。中ＳＩＶｍａｃ感染剂量（１０～１００ＭＩＤ５０和先感染后给药方式，中药Ⅰ号未能抑制感染后２周的血浆病毒水平，但与对照组比较明显降低感染２周后的血浆病毒水平。表明中药Ⅰ号有抗猴体内病毒的作用。本模型亦可应用于中药方剂猴体内抗病毒的效果评价。     

SHIV-KB9感染中国恒河猴的实验研究

目的研究SHIV-KB9感染中国恒河猴的可能性,确定其有效病毒浓度,明确实验猴感染SHIV-KB9后的病毒复制和免疫反应情况,建立SHIV/SAIDS模型,并确定、完善SHIV/SAIDS模型评价指标。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查。选出6只无SIV、STLV、SRV/D和B病毒感染的恒河猴,分别用10倍系列稀释的病毒液静脉感染实验猴,使用流式细胞术、血常规检测、病毒分离、DNA-PCR和RT-PCR等方法确定实验猴是否被感染,以及感染后恒河猴体内病毒复制和免疫细胞损伤情况,持续测定3个月。结果实验猴的血浆病毒载量、病毒分离结果、CD4+/CD8+比值和CD4+细胞数等证实,4.8×106copies/mL以上浓度的SHIV-KB9病毒液能成功感染中国恒河猴。结论SHIV-KB9成功感染中国恒河猴为进一步建立SHIV/SAIDS模型奠定了良好的实验基础,为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了条件。     

中国恒河猴CD8+T细胞缺失模型制备

目的：测试用抗-HuCD8^＋T细胞单克隆抗体方法去除中国恒河猴体内CD8^＋T细胞效果，为建立CD8^＋T细胞缺失恒河猴模型提供实验依据。方法：抗-HuCD8^＋T抗体cM-T807在0、3、7d注射2只中国恒河猴，不同的时间取外周血，腹股沟和腋下淋巴结。制备CD3／CD4／CD8标记的外周血和淋巴细胞悬液，流式法测定恒河猴外周血和淋巴结中CD8^＋T细胞的去除效果。结果：注射了cM-T807的中国恒河猴，24h后，外周血中的CD8^＋T细胞缺失99．9％，持续27d；168h后，淋巴结中CD8^＋T细胞缺失约90．0％，持续21d。结论：首次证实抗-HuCD8^＋T细胞抗体cM-T807能有效去除中国恒河猴体内CD8^＋T细胞，为建立CD8^＋T细胞缺失动物模型（CD8^＋T Cells del）奠定基础。     

椎痛消胶囊对腰椎间盘突出症大鼠炎性细胞的影响

目的通过椎痛消胶囊药效学实验,评价炎性细胞在腰椎间盘突出症中的作用及椎痛消胶囊对其的影响。方法将健康雄性Wistar大鼠60只随机分为椎痛消胶囊高、中、低剂量组及阳性对照组、模型对照组、正常对照组,每组10只。采用自体髓核植入,模拟腰椎间盘突出症模型。各组连续给药30d,正常对照组、模型对照组灌服等量蒸馏水。对各组大鼠的背根神经节、神经根进行组织学观察,计数炎性细胞。结果模型组神经节、神经根均出现明显的炎性细胞漫润;椎痛消胶囊高、中、低剂量组及阳性对照组的背根神经节、神经根术后的炎性细胞漫润数目明显减少,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.001),相应的神经根损害明显减轻。结论髓核组织介导的炎性细胞浸润及炎症反应在腰椎间盘突出症中起重要作用;椎痛消胶囊能有效减少炎性细胞浸润、减轻炎症反应和神经组织的损伤,对促进突出物的吸收有重要意义。     

猴B病毒抗体不同检测方法的比对

目的猴B病毒(monkey B virus,BV),也称猴疱疹病毒I型(Cercopithecine herpesvirus 1),是重要的人兽共患病原。根据国家标准,猴B病毒作为抗原检测抗体,但由于生物安全问题,抗原制备受到很大限制,因此使用替代抗原进行抗体血清学检测并进行比对验证。方法应用2种ELISA方法(抗原分别为BV和HVP2)和1种免疫酶法EIA方法(抗原为HSV-1)对本实验室135份送检恒河猴血液样品进行筛查,对阳性及可疑样品再以免疫荧光法IFA和Western blot方法(抗原为HSV-1)以及以HSV-1 g C1纯化糖蛋白为抗原的免疫印迹方法验证。结果HVP2-ELISA、BV-ELISA和HSV-1-EIA阳性检出率分别为32.6%、37.8%和34.8%;3种方法检测结果一致的样品占91.1%(123/135),阳性结果可被IFA和WB确证;可疑样品12份,33.3%(4/12)的样品经验证检验为阳性。结论与BV抗原相比,替代抗原HSV-1的敏感性和特异性较HVP2更为接近;阳性样品及可疑样品的确证检验应使用多种方法,避免漏检。     

恒河猴离乳幼猴B病毒动态监测

目的调查恒河猴离乳幼猴BV感染的动态变化,探讨早期控制的可能。方法采用BV全病毒为抗原的ELISA试剂盒,对两批离乳后群养的54只恒河猴幼猴每月采血检测BV感染情况,连续检测13个月。结果随月龄的增加,BV感染率上升,其中12月、1月、2月、3月、4月BV阳性猴数量相对增加较明显。结论幼猴性成熟期之前BV感染率超过70%且呈现出一定的变化规律,春、冬季BV的感染率相对较高,应早期加强BV的有效预防控制,降低BV的感染,提高猴群质量。     

枸杞子乙酸乙酯提取部位的抗氧化活性研究

【目的】研究枸杞子乙酸乙酯提取部位的抗氧化作用。【方法】采用荧光分光光度法研究其抗羟自由基作用;采用紫外可见分光光度法研究其抗氧自由基作用及氧自由基对红细胞的氧化作用。【结果】枸杞子乙酸乙酯提取部位对.OH有很强的抑制和清除作用,并具有浓度依赖性;可清除邻苯三酚自氧化体系产生的O2-.,对抗O2-.对红细胞的氧化作用。【结论】枸杞子乙酸乙酯提取部位具有较好的抗氧化能力。     

超声波均质化对仙台病毒ELISA测试中抗原稳定性的影响

目的研究超声波均质化(homogenization)处理对于仙台病毒在ELISA测试中抗原稳定性的影响。方法对BHK-21细胞内扩增培养的仙台病毒通过差速离心,富集后使用超声波做均质化处理,和未处理的病毒分别包被酶标板,使用标准免疫小鼠血清和SPF小鼠血清对包被平板进行测试,比较样品测试孔间测量数据的变异率。结果对免疫血清做梯度稀释,各梯度样品在未经超声处理仙台病毒抗原包被ELISA检测中测量值的变异率在1.97%～6.02%之间;在经超声处理仙台病毒抗原包被ELISA检测中测量值的变异率在0.53%～2.26%之间;SPF血清测量值的变异率均高于免疫血清;所有样品在经超声处理的病毒抗原包被ELISA检测中测量值的变异率均较小。结论超声波处理有效的提高了仙台病毒抗原的均质性,在ELISA测试中提高了抗原的稳定性。