兔荧光扩增片段长度多态性分析体系的建立

目的:建立兔荧光扩增片段长度多态性(fluorescent amplification fragment length polymorphism,fAFLP)分析方法并对其在实验动物科学中应用进行探讨。方法:本实验以5个品种(系)兔为实验材料,对DNA提取、预扩增和选择性扩增等步骤进行优化并对结果进行检测。结果:5个品种(系)兔的扩增片段数均在120条以上,各品种(系)特异性条带均能找出,5个品种(系)兔能据此进行区分。结论:fAFLP是一种以PCR为基础的DNA指纹技术,为兔的指纹分析提供了一种快速高效的方法,可用于兔的遗传质量检测。     

兔的单引物PCR指纹分析

本研究结合ＤＮＡ指纹杂交和随机扩增多态性ＤＮＡ(ＲＡＰＤ)技术 ,探索了适用于动物基因组的操作简捷、快速以及敏感性可靠性强的分子标记方法———单引物ＰＣＲ指纹技术。应用单引物ＰＣＲ指纹技术 ,采用的 1条小卫星引物Ｍ13(5′ＧＡＧＧＧＴＧ ＧＣＧＧＴＴＣＴ3′)和 2条微卫星引物 { (ＧＴＧ) 5、(ＧＡＣＡ) 4}对Ｖｃ Ⅰ系、Ｖｃ Ⅱ系獭兔、日本大耳白兔 (ＺＤＢ)和青紫蓝 (ＱＺＬ)四个品系各8只 ,总计 32个个体的遗传结构进行了分析。根据结构应用ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃＣｏｍｐｕｔｅｒＴｏｏｌｓ软件计算出四个品系间及 32个个…     

蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK~R的构建及其在山羊乳腺组织中的表达

目的在山羊奶中表达蚓激酶。方法将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中获得了蚓激酶重组逆转录病毒载体,转染泌乳期奶山羊乳腺小叶并获得暂时表达。利用脂质体转染PA317包装细胞,G418进行筛选得到阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清感染妊娠期奶山羊乳腺小叶组织,山羊产后采奶纤维蛋白平板溶圈法检测蚓激酶活性。结果产后奶样经纤维蛋白平板溶圈法检测羊奶具有明显纤溶活性。结论蚓激酶基因已经整合到奶山羊乳腺组织并能实现相对稳定的表达。     

小鼠体外受精、胚胎培养及胚胎快速冷冻的研究

本文系统研究了小鼠受精卵的体内发育与运行规律 ,卵母细胞的体外成熟与受精、单细胞胚胎培养及胚胎快速冷冻 ,结果如下 :①注射hCG后 1 2～ 2 0h受精卵发育至原核期 ,42～ 48h为 2 -细胞期 ,48～ 6 0h为 4-细胞期 ,6 0～ 6 8h为 8-细胞期 ,以上各期受精卵均处于输卵管中 ;75～ 78h为桑椹胚 ,78～ 80h为致密桑椹胚 ,90～92h为早期囊胚 ,92～ 96h为囊胚 ,以上各期均处于子宫角中 ;②培养液中添加激素 ,能显著提高卵母细胞的体外受精率 ,添加FCS和激素组的体外受精率又显著高于单独添加激素组 ,FCS还能显著提高胚胎发育率 ;③在培养液中添加EDTA ,能有效克服小鼠胚胎的 2 -细胞阻断 ,其 2 -细胞胚的发育率达 1 0 0 % ,8-细胞胚的发育率达55%以上 ;牛、羊上皮细胞培养上清也能有效克服 2 -细胞阻断。添加乳酸钠和丙酮酸钠可使 2细胞与 8细胞的发育率显著提高 ;④以D -PBS +甘油 +蔗糖为冷冻液 ,以D -PBS +蔗糖为稀释液 ,对小鼠胚胎进行快速冷冻 ,桑椹胚的存活率为 6 9.3% ,早期囊胚的存活率为 6 0 .4%。以上研究为建立小鼠胚胎库提供了基础     

泌乳乳腺作为真核基因的有效表达系统研究

目的 探讨泌乳腺组织作为真核基因快速表达系统的可行性。方法 以蚓激酶（LK）作为目的标志基因，分别构建了在泛组织嗜性的巨细胞病毒（CMV）立即早期启动子、逆转录病毒长末端重复序列（LTR）和组织特异性的beta-酪蛋白启动子调控下的3种真核表达载体pICLK、pLLKSN和pIbLK。制备各重组质粒后，以泌乳期羊乳腺作为支持系统，在处于稳定泌乳阶段分别注射不同量的重组质粒于山羊乳腺组织中。在注射后不同时间采集奶汁，检测纤溶活性。结果蚓激酶的不同重组质粒在注射到乳腺组织之后迅速得到表达，注射后6～9h蚓激酶表达量达到高峰，并可持续至72h以上；不同表达载体间表达量略有变化，但差异无统计学意义。结论 泌乳乳腺组织可以作为真核基因的1种快速有效的表达系统。     

小鼠体外受精、胚胎培养及胚胎快速冷冻的研究

目的　为扩大胚胎来源并获取特定胚龄胚胎 ,建立小鼠冷冻胚胎库。方法　运用超数排卵、体外受精与胚胎培养及胚胎冷冻技术系统研究了小鼠受精卵的体内发育与运行规律。卵母细胞的体外成熟与受精、单细胞胚胎培养及胚胎快速冷冻。结果　 (1)注射hCG后 12～ 2 0h受精卵发育至原核期 ,4 2～ 4 8h为 2 细胞期 ,4 8～ 6 0h为 4 细胞期 ,6 0～ 6 8h为 8 细胞期 ,以上各期受精卵均处于输卵管中 ;75～ 78h为桑椹胚 ,78～ 80h为致密桑椹胚 ,90～ 92h为早期囊胚 ,92～ 96h为囊胚 ,以上各期均处于子宫角中。 (2 )培养液中添加促性腺激素 (FSH与hCG) ,能显著提高卵母细胞的体外受精率 ,添加FCS和激素组的体外受精率又显著高于单独添加激素组 ,FCS还能显著提高胚胎发育。 (3)在培养液中添加EDTA ,能有效克服小鼠胚胎的 2 细胞阻断 ,其 2 细胞胚的发育率达 10 0 % ,8 细胞胚发育率达 5 5 %以上 ;牛、羊上皮细胞培养液上清也能有效克服 2 细胞阻断。添加乳酸钠和丙酮酸钠可使 2细胞与 8细胞期胚的发育率显著提高。 (4)以D PBS +甘油 +蔗糖为冷冻液 ,以D PBS +蔗糖为稀释液 ,对小鼠胚胎进行快速冷冻 ,桑椹胚的存活率为 6 9 3% ,早期囊胚的存活率为 6 0 4 %。结论　研究为将生物技术应用于小鼠 ,扩大卵子和胚胎来源     

胚胎生物技术在实验动物中的应用与展望

本文系统论述了实验动物的胚胎移植、排卵控制、孤雌生殖、体外受精、显微受精、胚胎分割与嵌合、胚胎克隆、配子与胚胎的冷冻保存、胚胎干细胞等技术的国内外研究进展与动态。结合我国实验动物的研究现状，对其在实验动物中的应用与发展前景做了阐述。     

人C-myc乳腺定位表达转基因小鼠模型的建立

以ｐＣＡＴ ＷＡＰ和ｐＷＭ为原始质粒 ,构建ＷＡＰ启动子调控ｃ ｍｙｃ的乳腺组织特异性表达载体ｐＷＣＳ。载体用Ｂｇ1Ⅱ +ＢａｍＨⅠ酶切 ,回收基因片段 3 5ｋｂ的ＷＡＰ ｃ ｍｙｃｌ ＳＶ4 0 ＰｏｌｙＡ ,通过显微注射方法导入Ｃ57ＢＬ 6Ｊ×ＤＢＡ 2ＪＦ1 代小鼠受精卵的雄原核内。共注射 10 0 0枚卵 ,将存活的约 6 0 0枚卵分别移植至 2 9只假孕母鼠输卵管内 ,获得仔鼠 4 5只。ＰＣＲ检测 ,阳性鼠 9只 ,Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测 ,阳性鼠 3只 ,其中 1只母鼠 ,2只公鼠 ,在饲养过程中 ,1只母鼠意外死亡。对 2只转基因公鼠的Ｆ1代ＰＣ…