肝癌组织特异性蛋白磷酸酶2A催化性C亚基α亚型显性负性突变体表达载体抑制肝癌移植瘤生长的体内研究

目的 构建腺病毒为载体的肝癌组织特异性启动子驱动的蛋白磷酸酶2A催化性C亚基α亚型显性负性突变体(domina negative form of protein phosphatase 2A catalytic subunit α,DN-PP2Acα)表达载体,研究其对肝癌生长的影响.方法 前期研究已构建了甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)基因增强子和磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase,pgk)基因启动子组合形成的肝癌组织特异性AFpg启动子,并将AFpg启动子和DN-PP2Acα编码序列构建成AFpg启动子调控的DN-PP2Acα表达载体.将该载体重组到腺病毒载体中.Western印迹法检测PP2Ac表达水平.MTT法检测细胞生长.用荷瘤裸鼠进行体内研究.结果 AFpg启动子调控的DN-PP2Acα表达载体可特异性地使DN-PP2Acα表达于AFP阳性肝癌细胞HepG2,并抑制细胞及移植瘤的生长,而对AFP阴性肝癌细胞株SK-HEP-1、正常肝细胞株L-02和移植瘤的生长无明显影响.结论 AFpg启动子调控的DN-PP2Acα表达载体能特异性地抑制AFP阳性肝癌细胞的生长,可用于肝癌组织特异性基因治疗.     

蛋白磷酸酶2A抑制剂通过c-Jun氨基末端激酶/蛋白激酶B通路抑制胰腺癌细胞生长的机制

斑蝥素是蛋白磷酸酶2A( protein phosphatase 2A,PP2A)的抑制剂[1].PP2A可使c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)等参与细胞生长的多种激酶去磷酸化而失活.本研究拟检测斑蝥素和经典的PP2A抑制剂冈田酸对胰腺癌细胞JNK/Akt信号通路的活性及细胞生长的影响.     

蛋白磷酸酶2A抑制剂对胰腺癌细胞活力的影响及其机制

目的 研究蛋白磷酸酶2A(PP2A)抑制剂对胰腺癌细胞系PANC-1活力的影响及其机制.方法 用PP2A抑制剂斑蝥素和冈田酸处理PANC-1细胞.通过Western印迹检测核因子(NF) -κB通路的激活程度.通过转染PP2A活性亚基cα(PP2A cα)表达质粒、NF-κB抑制蛋白激酶(IKK)α和NF-κB抑制蛋白(IκB)α的显性负性突变体、p65干扰质粒,分别从各环节阻断NF-κB通路,通过四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测细胞活力.结果 PP2A抑制剂可使IKKa磷酸化,进一步使IκBa磷酸化并降解,继而释放p65入核.过表达PP2Acα、IKKα显性负性突变体、IκBα显性负性突变体或干扰p65可分别使斑蝥素对细胞活力的抑制率下降(31.85±13.37)％、(23.48±8.98)％、(22.63±5.81)％、(20.88±3.24)％,使冈田酸对细胞活力的抑制率下降(40.17±11.65)％、(27.34±14.28)％、(24.85±3.39)％、(27.08±3.81)％.结论 PP2A抑制剂通过PP2A/IKKα/IκBα/p65依赖性通路发挥抗胰腺癌作用.     

多供体造血干细胞移植术后的嵌合率定量检测

本研究旨在建立检测多供体造血干细胞移植术后供体细胞嵌合率(DD-CHM%)的计算模型并简化计算方法。以接受异基因造血干细胞移植的血液系统疾病患者为研究对象,采用STR-PCR结合毛细管电泳的方法,检测移植术后供体细胞嵌合率。结果表明:在混合嵌合状态下,同一个体来源的等位基因的双峰面积和高度是近似的,可以互相替代;对构建的计算模型中各等位基因的峰面积进行赋值,得到的嵌合率准确值和近似值在可接受的计量系统自身误差范围内(5%-20%)是基本没有差异的。结论:在混合嵌合状态下,来自于同一个体的等位基因在STR位点上的非共享峰是可以替代共享峰面积,此设想可以用作于计算多供体造血干细胞移植术后嵌合率的检测;在计算位点选择上,受体位点的选择比供体位点选择更为重要,能更加有效的简化计算步骤,并能更准确的得到供体细胞嵌合率的结果。     

斑蝥素对胰腺癌细胞系PANC1、CFPAC-1的凋亡诱导作用及机制研究

目的 研究斑蝥素对胰腺癌细胞系PANC1、CFPAC-1的凋亡诱导作用及机制。方法 用斑蝥素处理PANC1、CFPAC-1细胞。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;酶化学法检测caspase活性;RT-PCR及蛋白质印迹法检测凋亡相关基因的表达。结果 斑蝥素呈剂量依赖性明显抑制胰腺癌细胞系PANC1、CFPAC-1增殖及诱导细胞凋亡。10μmol/L斑蝥素处理细胞72 h,PANC1、CFPAC-1细胞的增殖抑制率最高,分别达(52.95 +6.34)％和(71.21 +6.30)％。处理24h,PANC1细胞的早期和晚期凋亡细胞分别从7.35％增加到24.89％、6.36％增加到17.73％;CFPAC-1细胞从6.39％增加到24.70％、9.21％增加到12.58％(P值均＜0.01)。PANC1细胞的caspase 8和caspase9活性分别为对照组的(155.8±11.5)％和(194.6±14.7)％;CFPAC-1细胞分别为对照组的(182.5±24.3)％和(215.8±12.2)％(P值均＜0.01)。促凋亡基因TNF-α、TRAILR1、TRAILR2、Bad、Bak和Bid表达增加,抗凋亡基因Bcl-2表达减少。结论 斑蝥素通过激活Caspase、上调促凋亡基因及下调抗凋亡基因的表达从而诱导胰腺癌细胞凋亡。     

蛋白磷酸酶2A抑制剂通过核因子-κB通路激活胰腺癌细胞外源性凋亡通路的机制

目的 探讨蛋白磷酸酶2A(PP2A)抑制剂通过激活核因子-κB(NF-κB)通路诱导胰腺癌细胞株人胰腺癌细胞(PANC-1)凋亡的机制.方法 荧光素酶报告基因检测NF-κB通路的激活水平,试剂盒检测半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-8、9活性,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测NF-κB通路下游凋亡相关基因表达水平.结果 PP2A抑制剂斑蝥素、冈田酸可激活NF-κB通路,分别使NF-κB转录活性上升(10.11 ±4.09)倍、(16.21 ±5.75)倍.NF-κB通路抑制剂Bay 11-7082预处理,可分别使斑蝥素、冈田酸诱导的NF-κB转录活性上升幅度下降(61.19±6.08)％、(62.09±12.38)％;斑蝥素、风田酸可激活外源性凋亡通路,分别使Caspase-8活性上升(0.55 ±0.12)倍、(0.85±0.21)倍.Bay 11-7082预处理,可分别使斑蝥素、冈田酸诱导的Caspase-8活性上升幅度下降(20.99±7.13)％、(29.07±7.98)％;斑蝥素、冈田酸可激活内源性凋亡通路,分别使Caspase-9活性上升(1.35 ±0.20)倍、(1.18±0.19)倍,但Bay 11-7082预处理,对斑蝥素、冈田酸诱导的Caspase-9活性上升幅度无明显影响;斑蝥素、冈田酸可上调促凋亡基因的表达;Bay 11-7082预处理可抑制斑蝥素、冈田酸诱导的促凋亡基因表达上调.结论 PP2A抑制剂通过NF-κB通路依赖性机制激活胰腺癌细胞外源性凋亡通路,并上调促凋亡基因的表达.     

蛋白磷酸酶2A抑制剂通过核因子-KB通路诱导胰腺癌细胞株PANC-1凋亡

目的 探讨蛋白磷酸酶2A(PP2A)抑制剂斑蝥素和冈田酸通过激活核因子-κB(NF-κB)通路诱导胰腺癌细胞株PANC-1凋亡的作用机制.方法 PP2A抑制剂处理胰腺癌细胞后,噻唑蓝(MTr)检测细胞活力,流式细胞术检测凋亡水平,Western blot检测NF-κB通路的激活水平.结果 PP2A抑制剂显著抑制胰腺癌细胞活力,呈剂量和时间依赖性,并可诱导细胞凋亡;PP2A抑制剂激活NF-κB通路的上游激酶IKKα,导致IκBα磷酸化并降解,并释放p65入核,从而激活NF-κB通路;阻断NF-κB通路,可削弱PP2A抑制剂的细胞毒性作用.结论 PP2A抑制剂通过NF-κB通路依赖性机制诱导胰腺癌细胞凋亡,有望用于胰腺癌治疗.     

蛋白磷酸酶2A催化亚基α显性负性突变体表达载体对肝癌细胞生长的影响

目的 构建肝癌组织特异性启动子驱动的蛋白磷酸酶2A催化亚基α显性负性突变体(DN-PP2Acα)表达载体,研究其对肝癌细胞生长的影响.方法 将甲胎蛋白(AFP)基因的增强子和磷酸甘油酸激酶(pgk)基因的启动子组合形成的肝癌组织特异性AFpg启动子.采用定点突变将野生型蛋白磷酸酶2A催化亚基α(PP2Acα)突变为DN-PP2Ac α.将AFpg启动子和DN-PP2Ac α编码序列构建成AFpg启动子调控的DN-PP2Ac α表达载体pGL3-Basic-AFpg-PP2Acα.荧光素酶报告基因实验检测AFpg启动子的转录活性.质粒pcDNA3.1(+)、pGL3-Basic、pcDNA3.1 (+)-DN-PP2Acα、pGL3-Basic-AFpg、pGL3-Basic-AFpg-PP2Ac α分别转染L02、SK-Hep-1、HepG2和Hep3B细胞,Western blot检测PP2Ac蛋白表达水平,四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞生长情况.成组t检验分析不同处理组间的细胞活力差异.结果 L02、SK-Hep-1、HepG2和Hep3B细胞中,AFpg启动子相对荧光素酶活性分别为3.61±1.07、3.46±0.66、98.70±18.60、88.70±19.53,AFpg启动子在表达AFP的细胞中具有高转录活性.pGL3-BaSic-AFpg-PP2Acα可特异性地使DN-PP2Ac α表达于AFP阳性肝癌细胞HepG2和Hep3B,并抑制其生长,转染72 h后,HepG2细胞活力下降42.65％±3.99％,Hep3B细胞活力下降39.87％±3.91％,与0h时比较,差异均有统计学意义(t值分别为13.0563和12.9920,P值均＜0.01).pGL3-BaSic-AFpg-PP2Ac α对AFP阴性细胞的生长无明显影响.结论 AFpg启动子调控的DN-PP2Acα表达载体特异性地抑制AFP阳性肝癌细胞的生长,可用于肝癌组织特异性基因治疗.