cAMP衍生物特异性激活Epac2/Akt信号通路促进大鼠脊髓损伤的修复

目的 研究应用cAMP衍生物特异性激活Epac2/Akt信号通路在哺乳动物脊髓损伤中的病理和生理机制.方法 96只成年健康雌性SD大鼠,完全随机分为4组(n=24),A、B、C组均采用改良Allen重物打击法制备大鼠脊髓损伤模型.A组给予8-CPT-2’-O-Me-cAMP 0.5 mg/(kg·d)、B组给予等量10％(体积分数)DMSO、C组给予8-CPT-2’-O-Me-cAMP 0.5 mg/(kg·d)加LY294002 0.2 mg/(kg·d)各7d.D组为正常对照组.各组分别于1、2、3、4周采用BBB评分法评估大鼠后肢功能恢复情况,各时间点取材行HE染色、免疫荧光、实时荧光定量PCR检测脊髓细胞标志物(Nestin、NF200、GFAP)和通路因子(Epac2、Akt)的表达.结果 A组大鼠在术后1～4周BBB评分持续升高,均高于B、C组(P＜0.01),低于D组(P＜0.01).在1、2、3周,A组Epac2 mRNA表达与C组Epac2 mRNA表达差异无意义,但高于B组(P＜0.01)和D组(P＜0.01).A组Akt mRNA表达高于B、C、D组(P ＜0.01).A组Nestin、NF200 mRNA表达在各期均高于B、C、D组(P＜0.01).A、B、C组GFAP mRNA表达差异无统计学意义.HE染色可见A、B、C组造模后脊髓组织结构疏松,有大量空洞形成.免疫荧光染色并进行积分光密度值分析,其结果与实时荧光定量PCR检测结果相符.结论 在哺乳动物脊髓损伤后应用cAMP衍生物能够特异性激活Epac2/Akt通路,促使神经干细胞分化和神经细胞增殖,有助于脊髓修复.     

骨髓间充质干细胞与去细胞肌肉生物支架体外相容性研究

[目的]研究骨髓间充质干细胞与去细胞肌肉生物支架体外相容性,进一步探讨联合二者移植修复脊髓损伤可能性.[方法]采用改良化学方法制备去细胞肌肉生物支架并复合冷灭菌方法灭菌,密度梯度离心法体外分离、贴壁法培养BMSCs,注射法接种第3代细胞于支架.[结果]H-E常规染色观察支架内部呈平行走行,Masson染色示支架内平行结构主要为胶原纤维,几乎没有肌纤维.接种BMSCs于支架并孵育14 d后,Hoechest 33342荧光标记计数显示大量存活细胞,扫描电镜可见细胞贴附于支架内表面生长.[结论]去细胞肌肉生物支架具有规则的内部结构是细胞移植理想载体.BMSCs能与去细胞肌肉生物支架体外相容并存活至少2周,为进一步体内联合移植修复脊髓损伤提供实验支持.     

维生素B1介导的Akt/mTOR/STAT3信号通路在谷氨酸诱导的PC12细胞损伤中的作用

[目的]研究维生素B1(thiamine,VitB1)介导的Akt/mTOR/STAT3信号通路在谷氨酸(glutamate,Glu)诱导的PC12细胞损伤中的作用.[方法]应用MTT法检测不同浓度谷氨酸对PC12细胞作用不同时间的细胞生长抑制率,筛选出合适的作用浓度与作用时间后,将细胞分为4组,分别为A组:正常对照组;B组:20 mmoL/L谷氨酸处理组;C组:20 mmol/L谷氨酸+300 μmol/L维生素B1处理组;D组:20 mmol/L谷氨酸+300 μmol/L维生素B1+ 800 nmol/L雷帕霉素(rapamycin,RAPA)处理组.应用流式细胞术观察各组作用12 h后细胞凋亡率,Western blot观察各组处理1、4、8、12 h后,p-Akt,p-mTOR,p-STAT3蛋白表达情况.[结果](1)谷氨酸对PC12细胞的生长抑制作用随作用时间和作用浓度的增加而增强;(2)A组的凋亡率为(3.42±0.79)％;C组凋亡率为(23.85±1.58)％,明显低于B组(40.20±2.54)％和D组(53.49±2.83)％(P＜0.01);(3) Western blot 检测结果表明C组各时间点p-Akt,p-mTOR,p-STAT3表达均高于A、B、D组,并且p-Akt表达量在1h时最高,p-mTOR和p-STAT3在4h时达到高峰.[结论]维生素B1激活了细胞Akt/mTOR/STAT3信号通路,该通路对谷氨酸诱导的神经细胞损伤起到了保护作用.     

BMSCs联合去细胞肌肉生物支架修复大鼠脊髓半切损伤的实验研究

目的以去细胞肌肉生物支架(acellular muscle bioscaffolds,AMBS)接种BMSCs,同种异体移植修复大鼠脊髓半切损伤,观察两者联合移植对脊髓损伤的修复作用。方法取8周龄雌性SD大鼠,采用改良化学方法制备AMBS,并进行复合冷灭菌;密度梯度离心法提取、贴壁法培养BMSCs,取第3代细胞用Hoechst 33342荧光标记,采用注射法制备BMSCs-AMBS复合支架,14 d后扫描电镜及荧光显微镜观察其生物相容性。取成年雌性SD大鼠48只,制备T9～11脊髓半切损伤模型后随机分为4组(n=12),A组于缺损处移植BMSCs-AMBS复合支架,B组单独移植BMSCs,C组单独移植AMBS,D组注射PBS作为空白对照组,分别于术后1、2、3、4周行运动功能评分,术后4周行HE染色观察及免疫荧光检测。结果 Masson染色及HE染色示AMBS内部呈平行结构,主要为胶原纤维,几乎无肌纤维。BMSCs-AMBS复合培养14 d后荧光显微镜观察示Hoechst 33342标记BMSCs大量存活,扫描电镜可见BMSCs贴附于支架内表面生长。术后2～4周,大鼠BBB评分A组均高于其余3组(P<0.05),D组明显低于其余3组(P<0.05);术后4周B组明显高于C组(t=10.352,P=0.000)。术后4周,HE染色示脊髓空洞面积A组明显小于其余3组,免疫荧光染色示A组神经丝蛋白200、巢蛋白阳性细胞表达量高于其余3组,神经胶质原酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)则明显低表达。A、B组荧光示踪的BMSCs移植到体内后主要迁移至对侧灰质前角,部分分化为神经元样细胞。A、B、C、D组GFAP荧光半定量分析积分吸光度(IA)值分别为733.01±202.04、926.42±59.46、1 069.37±33.42、1 469.46±160.53,A组明显低于其余3组,D组高于其余3组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 AMBS具有相对规则的内部结构,与BMSCs有良好生物相容性,能抑制胶质瘢痕,促进BMSCs存活、迁徙、分化,是细胞移植理想的天然载体。两者联合移植修复大鼠脊髓损伤能发挥协同作用,促进运动功能恢复。     

去细胞肌肉生物支架与人脐带间充质干细胞的相容性

背景：去细胞肌肉生物支架联合人脐带问充质干细胞移植将是治疗脊髓损伤的一项重要措施。但两者是否具有良好的相容性,人脐带间充质干细胞能否在去细胞肌肉生物支架中长期存活并均匀分布,尚未得到证实。目的：观察大鼠去细胞肌肉生物支架与人脐带间充质干细胞的相容性。方法：改良化学法制备大鼠去细胞肌肉生物支架,将第3代人脐带间充质干细胞Hoecliest33342荧光标记后分为3组进行实验,细胞＋支架组、细胞＋支架大鼠体内组和单纯细胞组。分别应用苏木精-伊红、Masson染色方法观察去细胞肌肉生物支架的组织形态,以荧光倒置相差显微镜和扫描电镜观察人脐带间充质干细胞的吸附和生长情况。结果与结论：人脐带间充质干细胞与去细胞肌肉生物支架充分附着,生长增殖活跃,细胞在支架内分布均匀。细胞＋支架体内组与细胞＋支架组相比在移植后1—7d人脐带间充质干细胞数量差异无显著性意义（P〉0．05）,在移植14d细胞＋支架体内组人脐带间充质干细胞数量大于细胞＋支架组（P〈0．05）。提示去细胞肌肉生物支架与人脐带间充质干细胞有较好的相容性,体内环境更有利于细胞增殖和两者融合。     

三种方法构建去细胞肌肉生物支架:组织学和生物力学比较

背景:目前构建去细胞肌肉生物支架的方法有化学方法、物理冻融法和冷冻法。目的:比较化学方法、物理冻融法和改良化学方法构建去细胞肌肉生物支架组织学和生物力学差异。方法:将6只SD大鼠竖脊肌截成36段,随机分3组(n=12),分别采用化学方法、物理冻融方法、改良化学方法构建去细胞肌肉生物支架。将荧光标记的骨髓间充质干细胞接种于3组支架上进行组织学与生物力学检测。结果与结论:苏木精-伊红染色显示3组支架均可见平行排列结构,化学方法组连续性较物理冻融组、改良化学组差;Masson染色显示3组支架结构主要为胶原纤维,物理冻融组残留一些肌纤维,间隙不均。物理冻融组第7天荧光标记种子细胞计数明显少于化学方法组、改良化学组(P<0.01),第14天物理冻融组少于改良化学组(P<0.05);扫描电镜可见细胞贴附各组支架生长、大量存活;物理冻融组最大载荷高于化学方法组(P<0.05),与改良化学组无明显差别,各组弹性模量无差异;物理冻融组孔隙率低于化学方法组、改良化学组(P<0.05)。表明改良化学方法可以兼顾支架的组织学和生物力学特性,彻底清除肌细胞,较多保留更完整的细胞外基质。     

三种方法构建去细胞肌肉生物支架：组织学和生物力学比较

背景：目前构建去细胞肌肉生物支架的方法有化学方法、物理冻融法和冷冻法。目的：比较化学方法、物理冻融法和改良化学方法构建去细胞肌肉生物支架组织学和生物力学差异。方法：将6只SD大鼠竖脊肌截成36段,随机分3组（n=12）,分别采用化学方法、物理冻融方法、改良化学方法构建去细胞肌肉生物支架。将荧光标记的骨髓间充质干细胞接种于3组支架上进行组织学与生物力学检测。结果与结论：苏木精-伊红染色显示3组支架均可见平行排列结构,化学方法组连续性较物理冻融组、改良化学组差;Masson染色显示3组支架结构主要为胶原纤维,物理冻融组残留一些肌纤维,间隙不均。物理冻融组第7天荧光标记种子细胞计数明显少于化学方法组、改良化学组（P〈0.01）,第14天物理冻融组少于改良化学组（P〈0.05）;扫描电镜可见细胞贴附各组支架生长、大量存活;物理冻融组最大载荷高于化学方法组（P〈0.05）,与改良化学组无明显差别,各组弹性模量无差异;物理冻融组孔隙率低于化学方法组、改良化学组（P〈0.05）。表明改良化学方法可以兼顾支架的组织学和生物力学特性,彻底清除肌细胞,较多保留更完整的细胞外基质。     

零切迹颈椎融合器治疗食管型颈椎病15例

目的:探讨零切迹颈椎融合器治疗食管型颈椎病的临床应用效果。方法:选取2012年4月到2018年9月确诊为食管型颈椎病的15例患者,行颈椎前路骨赘切除,零切迹颈椎融合器行病变椎间隙融合,详细记载手术时间、术中出血、术后早期的VAS评分、术后并发症;观察患者术后吞咽功能恢复情况,末次随访时胃镜检查观察食管压迫恢复情况,X线检查判断融合器及固定螺钉位置、椎间融合、骨赘复发等。结果:所有患者均被随访12个月。患者手术时间为65~150min,平均(88.00±23.28)min;术中出血量70~200mL,平均(97.40±31.47)mL;术后早期VAS评分0~5分,平均(2.20±1.37)分;所有患者均无并发症发生。患者术后早期吞咽困难症状均明显好转,末次随访时均完全消失,恢复后均未出现复发情况。末次随访时融合器及固定螺钉位置均良好,融合节段均坚固融合;均未发现明显骨赘复发;胃镜检查均发现食管后方压迫解除。结论:零切迹颈椎间融合器在食管型颈椎病治疗过程中操作简单,安全有效,术后无并发症且融合率高,适合临床使用。     

去细胞肌肉生物支架与人脐带间充质干细胞的相容性

背景：去细胞肌肉生物支架联合人脐带间充质干细胞移植将是治疗脊髓损伤的一项重要措施。但两者是否具有良好的相容性,人脐带间充质干细胞能否在去细胞肌肉生物支架中长期存活并均匀分布,尚未得到证实。 目的：观察大鼠去细胞肌肉生物支架与人脐带间充质干细胞的相容性。 方法：改良化学法制备大鼠去细胞肌肉生物支架,将第3代人脐带间充质干细胞Hoechest33342荧光标记后分为3组进行实验,细胞+支架组、细胞+支架大鼠体内组和单纯细胞组。分别应用苏木精-伊红、Masson染色方法观察去细胞肌肉生物支架的组织形态,以荧光倒置相差显微镜和扫描电镜观察人脐带间充质干细胞的吸附和生长情况。 结果与结论：人脐带间充质干细胞与去细胞肌肉生物支架充分附着,生长增殖活跃,细胞在支架内分布均匀。细胞+支架体内组与细胞+支架组相比在移植后1-7 d人脐带间充质干细胞数量差异无显著性意义(P > 0.05),在移植14 d细胞+支架体内组人脐带间充质干细胞数量大于细胞+支架组(P < 0.05)。提示去细胞肌肉生物支架与人脐带间充质干细胞有较好的相容性,体内环境更有利于细胞增殖和两者融合。     

交联温度对京尼平交联壳聚糖/藻酸盐组织工程支架的影响

[目的]通过对壳聚糖/藻酸盐复合支架材料表面结构、降解率、细胞毒性、孔隙率、含水量以及生物力学性能变化的研究,探究交联温度对京尼平交联壳聚糖/藻酸盐组织工程支架的影响.[方法]运用冷冻干燥法制备壳聚糖/藻酸盐支架材料,分别在4℃、25℃、37℃条件,于0.5％京尼平溶液中交联24 h,作为实验组.以未用京尼平交联的支架材料作为对照组,评价支架材料降解率、细胞毒性、孔隙率、含水量以及生物力学性能的特点.[结果](1)伴随交联温度升高,支架材料的颜色从浅紫色变为紫黑色,未交联的支架材料为白色;(2)降解率4周后在4℃为21.54％±3.07％、25℃组为9.9％±1.2％、37℃组为8.98％±0.79％.其中,37℃和25℃组抗降解能力优于4℃组(P＜0.05).各实验组均优于对照组(P＜0.01);(3)弹性模量在4℃组为0.84±0.55,25℃组为1.44±0.06,37℃组为1.53±0.02,对照组为0.79±0.16.对照组与25℃组及37℃组之间差异有统计学 意义(P＜0.05);(4)孔隙率、含水量、细胞毒性各实验组间未见明显差异.[结论]随着交联温度的提高,支架材料的抗降解能力、抗拉伸性能增加,且对支架材料的结构、细胞毒性、孔隙率以及含水量无明显影响.