碳源及添加模式对钝齿棒杆菌JDN28-75发酵生产L-精氨酸的影响

研究了不同碳源及添加模式对钝齿棒杆菌JDN28-75发酵生产L-精氨酸的影响,结果显示葡萄糖为合适的碳源.初始葡萄糖浓度为10%时,在发酵至24h左右补加葡萄糖有利于精氨酸的积累.5L全自动发酵罐中,初始葡萄糖浓度10%,发酵20h后以2.5g/h连续流加葡萄糖至总糖浓度为15%,与初糖浓度15%的批次发酵相比,L-精氨酸含量从2.98%升至3.72%,糖酸转化率由23.8%增至26.4%.     

L-精氨酸高产菌的诱变育种及其摇瓶产酸条件

以亚硝基胍(NTG)逐级处理钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)JDN28,分别选用D-精氨酸、甲基半胱氨酸为结构类似物进行抗性选育,获得一株L-精氨酸的高产菌株YDM403(His-,SGr,D-Argr,methyl-Cysr).在含葡萄糖120 g/L的优化培养基中,摇瓶发酵96 h,L-精氨酸达28～32 g/L,较出发菌株提高了113％.     

人GCSF-白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达

制备人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白.从新鲜人外周血中分离单核细胞,给予大肠杆菌脂多糖刺激后,RT-PCR制备G-CSF cDNA,以其为模板扩增得到人G-CSF的编码区序列(525 bp).重叠PCR拼接HSA-GCSF融合基因(2277 bp),序列测定正确,中间未加入任何连接肽.插入表达载体pPIC9K中a交配因子的开放阅读框内,构建分泌型表达重组质粒pPIC9K-HSA-GCSF.电击转化毕赤酵母菌KM71,G418筛选得到高拷贝转化子.甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的相对分子质量约为84 k,Western blot分析融合蛋白为G-CSF与HSA的杂合分子,NFS-60细胞/MTT比色法测定融合蛋白具有G-CSF的生物学活性.结果:构建了可分泌表达HSA-GCSF融合蛋白的毕赤酵母工程菌,为进一步对其进行药学研究奠定了基础.     

重组白蛋白人胰高糖素样肽-1突变体的串联体的融合蛋白在小鼠体内的药代动力学

目的研究重组白蛋白融合人胰高糖素样肽突变体的串联体rh(GLP-1A2G)2-HSA(GGH)在小鼠体内的药代动力学特性。方法采用氯胺T法标记目标蛋白rhGGH,γ放射免疫计数器检测三氯醋酸(TCA)沉淀前后血浆、组织、尿和粪的放射性计数,用DSA1.0软件拟合药物动力学模型,并计算相应动力学参数。结果 125I-rhGGH单次单剂量皮下注射后在小鼠体内的动力学过程符合二室模型,分布容积为53.4 mg.L-1.h-1,体内吸收相半衰期T12α为26.6 h,体内消除相半衰期T12β为57.8 h。125 I-rhGGH在小鼠甲状腺、血、胃、肝、肾、肺等组织器官中有较高的放射性摄取,而心、脑、胰腺、脾其它组织中放射性活度较小。125I-GGH主要经肾由尿排泄,给药后306 h,79.3%的药物由尿排出。结论小鼠体内的药代动力学表明rhGGH体内的半衰期明显优于非融合人胰高糖素样肽-1,因而使用rhGGH可以减少给药次数,并有可能提高疗效。     

融合蛋白GGH在小鼠体内的药效学评价

目的探讨融合蛋白(GLP-1A2G)2-HSA(GGH)对实验性β细胞轻度损伤的小鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)和胰岛功能的影响。方法对小鼠进行造模,血糖仪测定FBG,胰腺组织切片行HE染色,建立β细胞轻度损伤模型小鼠。实验分为正常对照组(normal control group,NC)、模型对照组(model group,DM)、GLP-1对照组、HSA对照组、Exendin-4(Ex-4)阳性对照组、GGH低(2 mg.kg-1)、中(6mg.kg-1)、高(18 mg.kg-1)剂量组(GGH 2、GGH 6、GGH18)治疗。记录14 d内的饮食、饮水、尿量、体重及FBG变化,放射免疫分析法测定空腹血清胰岛素水平(fasting seruminsulin,FINS),免疫组化方法观察胰岛β细胞增殖。结果 C57BL/6♂小鼠单剂量腹腔注射STZ 120 mg.kg-1 14 d后可成功制备稳定敏感的β细胞轻度损伤模型;治疗14 d,GGH中、高剂量组与DM组、GLP-1组、HSA组比较饮食、饮水、尿量减少(P均<0.05),FBG降低(P均<0.01),FINS升高(P均<0.05),胰岛细胞增殖增加(P均<0.05),GGH高剂量组的FBG、FINS与NC组、Ex-4组比较差异均无显著性(P均>0.05),胰岛细胞增殖与Ex-4组比较差异无显著性(P>0.05)。结论融合蛋白GGH通过促进β细胞的增殖和胰岛素的分泌而降低模型小鼠的高血糖,改善"三多一少"症状,其中GGH高剂量组的降糖药效与GLP-1受体激动剂Ex-4接近。     

基于蛋白酶活性控制的重组人β干扰素毕赤酵母表达体系优化

以毕赤酵母人β干扰素表达体系为研究对象,考察与蛋白酶活性相关的营养和环境因素对外源蛋白hIFN-HAS表达/降解的影响。结果表明,pH、谷氨酸和EDTA是显著影响hIFN-HAS表达的3个因素。通过响应面分析得到hIFNβ-HAS表达的最优条件为pH 5.5、谷氨酸0.18%、EDTA 12 mmol/L,目的蛋白表达量为24.46 mg/L。发酵终产物的电泳结果表明:条件优化后,hIFNβ-HSA降解带明显变淡,说明营养和环境因素的优化一定程度上抑制了蛋白酶的活性,由此增加了目的蛋白的积累。