中心组合设计法优化载基因壳聚糖纳米粒的最佳转染制备区域

目的：采用中心组合设计法优化载基因壳聚糖纳米粒的最佳转染制备区域。方法采用复凝聚法制备载质粒基因的壳聚糖纳米粒,选择壳聚糖浓度和质粒基因浓度作为实验考察因素,应用两因素五水平中心组合设计优化最佳转染制备区域,优化指标选择平均粒径和基因转染率。通过透射电镜观察纳米粒的形态;通过动态光散射和电泳光散射技术分别测量纳米粒的粒径和Zeta电位;通过凝胶电泳分析考察质粒在纳米粒制备过程中的稳定性;通过倒置荧光显微镜观察质粒基因在细胞内的表达;通过流式细胞技术测定纳米粒的转染效率。结果成功优化了载基因壳聚糖纳米粒的最佳转染制备区域。优选条件下制备的纳米粒大多呈球形,纳米粒平均粒径为217．6 nm,粒径多分散系数为0．241,表明粒径分布较窄。纳米粒zeta电位为＋22．4 mV,表明纳米粒表面带有正电荷,可以增加纳米粒混悬液的稳定性。凝胶电泳分析结果表明质粒基因在纳米粒制备过程中没有遭到破坏。纳米粒的细胞转染效率比较高,能够高效地将绿色荧光蛋白质粒基因递送到细胞内,并且基因表达产生绿色荧光蛋白。结论本研究建立的数学模型具有良好的预测性。在优化的制备区域内制备的载基因壳聚糖纳米粒的转染性能比较理想。     

大鼠脑胶质瘤荧光素酶动物模型建模细胞株C6-Luc的构建

目的 构建稳定表达萤火虫荧光素酶的大鼠脑胶质瘤细胞株C6-Luc.方法 通过浓度梯度法测定C6大鼠脑胶质瘤细胞的潮霉素最佳筛选浓度.使用FuGENE HD转染试剂将表达荧光素酶的真核质粒pGL4.50转染至C6细胞,应用潮霉素筛选多克隆细胞株,进一步采用有限稀释法筛选单克隆细胞株.采用报告基因分析对单克隆细胞株进行阳...     

非病毒性基因治疗递送载体(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k的构建及性能研究

目的构建非病毒性基因治疗递送载体(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k,探讨其细胞毒性及对质粒基因(pDNA)的递送性能。方法通过开环聚合反应制备共聚物mPEG5k-PCL1.2k-OH,将其羟基末端化学转化为N-羟基琥珀酰亚胺(-NHS)生成mPEG5k-PCL1.2k-NHS,随后同枝化PEI10k进行反应生成三元共聚物(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k。应用傅立叶变换红外光谱(FTIR)、核磁共振(NMR)和凝胶渗透色谱对(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k进行结构表征分析;通过MTT分析,比较(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k与PEI10k的细胞毒性;通过复凝聚法制备(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k/pDNA复合物;通过细胞转染实验,观察不同质量比的复合物转染细胞后报告基因的表达效果,考察转染时间和培养基pH值对报告基因表达的影响。结果成功合成了递送载体(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k。浓度小于62.5g/ml时,(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k的细胞毒性显著小于PEI10k。(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k载体能够压缩绿色荧光蛋白质粒报告基因(pEGFP)形成(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k/pEGFP复合物,并有效转染细胞获得目的基因表达;当载体与质粒的质量比为10∶1时,绿色荧光蛋白的表达效果最好。转染时间和培养基pH值均可影响(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k/pEGFP的转染效率,转染效率在48h优于24h和72h,pH6.8培养基优于pH7.2培养基。结论递送载体(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k细胞毒性较低,能够递送pDNA进入细胞并表达目的蛋白。     

多西他赛聚合物胶束的制备、表征及其对前列腺癌细胞LNCap-C4-2B的抑制作用

目的制备多西他赛-聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物(PEG-PCL-DTX,DTX-PMs)胶束,研究多西他赛-聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物的载药量、包封率及体外释放,考察对前列腺癌细胞株LNCaP-C4-2B的抑制增长效应。方法采用透射电镜观察纳米胶束的形态,采用激光粒度仪、高效液相色谱法对胶束的粒径,电位,载药量,包封率、体外释放进行研究;采用MTT法检测多西他赛-聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物对前列腺癌细胞LNCap-C4-2B的抑制作用,并与市售的多西他赛(多帕菲)进行比较。结果多西他赛-聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物胶束的载药量和包封率分别为(8.72±0.24)%和(98.1±1.6)%,平均粒径为(25.19±2.36)nm,电位为(0.64±0.15)mV;体外释放具有一定缓释效应;MTT试验结果显示,多西他赛-聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物能够很好地抑制LNCaP-C4-2B细胞的增长。结论多西他赛能够被多包载制备成胶束,其粒径小,稳定性好,可显著提高多西他赛在水相中的浓度,在体外具有良好的缓释效果和肿瘤细胞抑制作用。     

聚乙烯亚胺及其衍生物介导siRNA递送的研究进展

 目的 介绍非病毒载体聚乙烯亚胺（PEI及其衍生物介导小干扰RNA（siRNA递送的研究现状,为开发新型载体开阔思路。方法 查阅国内外有关文献,总结、归纳已报道的递送siRNA的各种PEI载体及其相关研究。结果与结论 综述了单独PEI、各种PEI衍生物递送siRNA的研究进展。PEI等聚合物基因载体由于其设计灵活在核酸递送中显示了巨大的潜力,随着对PEI聚合物转染机制的进一步研究与结构的合理修饰,PEI及其衍生物将会在非病毒载体领域扮演更重要的角色。     

Improved Anti-tumor Efficiency against Prostate Cancer by Docetaxel-loaded PEG-PCL Micelles简

This study primarily focused on the systematic assessment of both in vitro and in vivo anti-tumor effects of docetaxel-loaded polyethylene glycol（PEG）2000-polycaprolactone（PCL）2600 micelles on hormone-refractory prostate cancer（HRPC）. By using solvent evaporation method, PEG-PCL was chosen to prepare doxetaxel（DTX）-loaded mPEG-PCL micelles（DTX-PMs）, with the purpose of eliminating side effects of the commercial formulation（Tween 80） and prolonging the blood circulation time. The prepared DTX-PMs had an average particle size of 25.19±2.36 nm, a zeta potential of 0.64±0.15 mV, a polydispersity index of 0.56±0.03, a drug loading of（8.72±1.05）%, and an encapsulation efficiency of（98.1±8.4）%. In vitro cytotoxicity studies indicated that DTX-PMs could effectively kill LNCap-C4-2B cells and show a dose- and time-dependent efficacy. The hemolysis test showed that DTX-PMs had less hemocytolysis than the commercial product of Duopafei. A sustained in vitro release behavior and prolonged circulation time in blood vessels were observed in the DTX-PMs. Furthermore, when compared with Duopafei, the DTX-PMs dramatically reduced the prostate specific antigen（PSA） level and tumor growth of prostate tumor-bearing nude mice in vivo. In conclusion, the DTX-PMs can lower systemic side effects, improve anti-tumor activity with prolonged blood circulation time, and will bring an alternative to patients with HRPC.     

双氯灭痛-β-环糊精包含物的研制

通过冷冻干燥法和共沉淀法制备了双氯灭痛-β-环糊精包含物,经X-射线粉末衍射仪鉴定均已形成了包含物,收率、含量、工艺重现性等方面冷冻干燥法优于共沉淀法。冷冻干燥法和共沉淀法制备的包含物溶解度与单药相比分别增大0.85倍、0.67倍,溶出速率(T_(50))分别提前5.32min、2.90min,经方差分析有非常显著性差异(P<0.01)。     

人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因P1启动子区域CA微卫星多态性对启动子活性的影响

目的 探讨人胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因P1启动子区域CA微卫星多态性对启动子活性的影响.方法 收集131名健康中国人的血液样品,提取基因组DNA并进行基因扫描分析,测定人IGF-Ⅰ基因P1启动子区域CA微卫星多态性并计算其频率分布.通过PCR方法扩增含有不同长度CA微卫星的P1启动子单体型片段,插入至缺少启动子的pGL4.10质粒载体上的荧光素酶报告基因的上游.通过双荧光素酶报告基因分析法测定含不同长度CA微卫星的P1启动子单体型的活力,比较CA微卫星多态性对P1启动子活性的影响.结果 共发现9种CA微卫星多态性,分别为13CA、16CA、17CA、18CA、19CA、20CA、21CA、22CA和23CA,其中分布频率大于5%的有17CA、18CA、19CA、20CA和21CA多态性,分布频率最高的为19CA多态性.双荧光素酶报告基因分析结果表明,P1启动子单体型之间存在活力差异,其中16CA启动子单体型的活力最高,21CA启动子单体型的活力最低.结论 人IGF-Ⅰ基因P1启动子区域CA微卫星多态性能够影响P1启动子的活性.     

新型药物递送系统技术在药物研发中的应用和展望

<正>随着科学技术的蓬勃发展,近年来多种新型药物递送系统技术为解决现有药物的临床瓶颈提供了强有力的指导。回望发展,药物3D打印技术为制药行业带来新变革,将药物研发由传统工业化生产转变成个性化设计;跨越溶酶体递送策略推动了小核酸药物的研发与运用;以生物金属有机框架为代表的新型纳米药物递送系统解决了许多药物难以被高效输送到疾病部位的难题。     

烷基化低分子量聚乙烯亚胺作为基因递送载体的初步研究

目的 考察烷基化低分子量聚乙烯亚胺作为基因递送载体的安全性和有效性。 方法 以1-溴十二烷和分子量为1800的分枝状 PEI （bPEI1.8K）为原料,合成 bPEI1.8K-C12,并用1H-NMR 对其结构进行确认;采用 MTT 法考察 bPEI1.8K-C12的细胞毒性;红细胞溶血实验考察 bPEI1.8K-C12的生物相容性;测定bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的粒径分布和 zeta 电位;采用激光共聚焦显微镜观察 bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的细胞摄取行为;采用琼脂糖凝胶阻滞电泳考察 bPEI1.8K-C12对DNA 的固缩能力;并用荧光素酶报告基因和绿色荧光蛋白报告基因考察 bPEI1.8K-C12的体外转染效率。 结果 经1H-NMR 确认,成功合成了 bPEI1.8K-C12;MTT结果表明 bPEI1.8K-C12对人乳腺癌 MCF-7细胞的毒性与bPEI1.8K 相当;红细胞溶血实验结果表明高浓度 bPEI1.8K-C12静脉注射时具有潜在溶血性;质量比相同时,bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的平均粒径和 zeta 电位均比相应的bPEI1.8K/DNA 大;烷基化修饰后,bPEI1.8K-C12对 DNA 的固缩能力降低,MCF-7细胞对 bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的摄取效率大大增加,bPEI1.8K-C12递送报告基因质粒的体外转染效率显著高于 bPEI1.8K,甚至与 lipofectamine2000相当。 结论 bPEI1.8K-C12是一种安全高效的基因递送载体,具有较高的进一步开发前景。