重组血型改造工具酶稳定性的研究

目的研究血型改造工具酶,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在不同保存条件下的稳定性。方法以酶解B型红细胞的活性和纯度作为主要检测指标,考察重组α-半乳糖苷酶的热稳定性。重组α-半乳糖苷酶在70℃条件下保存1d,37℃保存60d,室温、4、-20、-70℃分别保存6个月,定期取样观察样品的外观,检测样品的pH值、纯度、酶活性,并进行无菌试验;为确保临床使用中的安全性和有效性,我们对4℃保存的样品进行了长达3年的观察。结果重组α-半乳糖苷酶在70℃保存1d后失活,37℃保存2个月后活性降低了11.5%,室温保存6个月后活性降低了19%,-70℃保存6个月后活性降低了13%,4℃、-20℃保存的样品6个月内各项指标均正常,均未见蛋白明显降解,蛋白活性保持稳定。4℃保存3年的样品酶活性保持稳定,可按原剂量在26℃,2h内成功地将B型红细胞改造成O型红细胞。结论重组α-半乳糖苷酶对热不稳定,应保存4℃或-20℃,在此条件下,有效期至少2年,能满足常规临床要求。     

重组α-N-乙酰半乳糖胺酶工程菌菌种稳定性研究

目的探讨重组α-N-乙酰半乳糖胺酶工程菌菌种的遗传稳定性。方法在有选择压力(AMP+)条件下,将重组a-N-乙酰半乳糖胺酶工程菌菌株在LB固体培养基上采用划线法连续传60代,每隔20代取样保存菌种,最后同时进行菌体形态、生长速度和抗生素抗性、质粒稳定性、限制酶切图谱、测序、表达量和酶活力及Westernblotting检测。结果第0、20、40、60代菌的菌体形态、生长速度和抗生素抗性等与原代菌株无明显差异;LB固体培养基上传60代后质粒稳定性接近100%;DNA测序未见α-N-乙酰半乳糖胺酶基因变异;SDS-PAGE图谱显示,α-NAGA表达水平无明显差别。Western blotting检测显示重组α-NAGA能与抗His的单抗特异结合。结论α-N-乙酰半乳糖胺酶重组质粒pET22b-α-NAGA在工程菌株中具有良好的遗传稳定性。     

利用新型α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造

目的利用原核生物来源的α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造研究。方法应用PCR的方法从脆弱类杆菌(Bacteriodes fragilis)中克隆了新型α-半乳糖苷酶基因,构建原核生物表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导α-半乳糖苷酶的胞内可溶性表达,应用重组酶的上清液进行B型红细胞(RBC)初步酶解试验。结果重组酶分子量约为64.6 kD,超声破碎的菌液上清中的酶活力约为2 U/ml。在26℃及pH 6.8的等渗柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系中2,h内完全酶解200μl B型RBC需要30μl的上清液,酶解后的B型RBC与抗-B和抗-A单克隆抗体不凝集,流式细胞术检测结果显示酶解后B型RBC的血型抗原呈现O型特征。结论重组的α-半乳糖苷酶可以有效的将B型RBC转变为O型RBC。     

抗Rh（D）抗体制备的研究进展

RhD抗原是表达在人类红细胞表面的血型抗原,其在免疫原性和临床上的应用仅次于ABO血型系统,相应的抗Rh（D）抗体在血型鉴定和预防新生儿溶血等方面均具有重要意义。传统的抗Rh（D）多克隆抗体来自健康人的血清,由于来源受限和血浆制品的安全问题,人们开始了抗Rh（D）的单克隆抗体和基因工程抗体的研究。国外研制的抗Rh（D）的单克隆抗体已成功用于血型鉴定,但到目前为止,还没有一个单克隆或者基因工程抗Rh（D）抗体作为多克隆抗Rh（D）抗体的替代品,在临床上用于预防Rh（D）免疫和新生儿溶血。本文对抗Rh（D）抗体制备的研究进展进行了综述。     

乙酰肝素酶可变剪接体Splice 5在CHO细胞中的稳定转染及其亚细胞定位研究

目的建立乙酰肝素酶可变剪接体Splice 5稳定转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株,并进行亚细胞定位分析。方法将表达乙酰肝素酶全长的质粒和乙酰肝素酶可变剪接体Splice 5质粒转染入CHO细胞,经G418进行筛选后,挑取单克隆进行培养,RT-PCR检测筛选克隆。用激光共聚焦显微镜测定其亚细胞定位。结果成功获得乙酰肝素酶可变剪接体Splice 5稳定转染株,并研究了其亚细胞定位情况。野生型乙酰肝素酶以颗粒状分布于细胞质中,Splice 5以弥散状分布于细胞质中,且在内质网、高尔基体、溶酶体、细胞膜均有分布。结论 Splice 5和野生型乙酰肝素酶在CHO细胞中分布形式和定位的不同,提示Splice 5可能具有其他的生物学功能。     

原核基因工程制备新型重组α-半乳糖苷酶应用于人B→O血型改造的研究

本研究利用基因工程方法制备脆弱类杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶并将其应用于人B→O血型改造.在获得了能够表达细菌α-半乳糖苷酶工程菌株的基础上,从诱导时间、诱导剂浓度两个方面对工程菌株的诱导条件进行优化,获得细菌α-半乳糖苷酶的最佳可溶性表达条件;超声上清经过阳离子交换层析和阴离子交换层析等方法进行纯化.利用纯化后的α-半乳糖苷酶在磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中处理B型红细胞2小时,制备O型红细胞.结果表明细菌α-半乳糖苷酶最佳诱导表达条件为:37℃、起始D(600)为0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为2小时.纯化后α-丰乳糖苷酶的纯度为电泳纯,比活由纯化前的0.42 U/mg提高到了2.1 U/mg.该酶在26℃、接近中性的pH条件(6.8)下经2小时可将B型红细胞改造成O型红细胞,需要的酶量为225μg/ml红细胞.结论:建立了重组细菌α-半乳糖苷酶的表达纯化工艺,制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,为B→O血型改造提供了更有效的工具酶.