新分呼肠科病毒形态及核酸研究

自我国西藏边陲地区采集的蜱、鸟、鼠标本经ＢＨＫ１３细胞培养，分离到明显致细胞病变的病毒１７株。制样后电镜观察，病毒呈球形含双层壳，大小为６８～８０ｎｍ，病毒性包涵体形成明显，病毒倾向于晶格样排列，经细胞裂解而释放。病毒感染的培养悬液及蔗糖密度梯度纯化的样品均可见形态一致的病毒颗粒，其形态及形态发生符合呼肠病毒科成员的特征。纯化病毒抽提核酸，电泳结果也显相同类属的图象，说明新分病毒为呼肠病毒科成员，从其明显致病性、宿主广泛性等可能为环状病毒属，类似于科罗拉多蜱传热病毒。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂衍生物在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达重组人组织型纤溶酶原激活剂衍生物(rPAm),并检测rPAm的活性。方法用PCR从质粒pLFrGGI上扩增出目的蛋白(rPAm)基因,再亚克隆到酵母表达载体pMEX9K中,转化到宿主菌GS115,菌落PCR鉴定转化子,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定表达产物,再通过层析法纯化目的蛋白,用溶圈法测定目的蛋白的活性。结果表达的重组蛋白分子量约为50kD。纯化后的目的蛋白的纯度可达到95%。Western-blot显示能与抗tPA抗体特异性结合,纯化后rPAm比活性为5.02×105IU/mg,比活性与t-PA相当。结论成功构建了rPAm酵母表达工程菌,建立了对目的蛋白的纯化方法。     

西藏环状病毒细胞生物学特性研究

目的：了解从西藏血蜱标本中分离的环状病毒（Ｔｉ３０１０）的细胞生物学特性和敏感细胞范围,与内其他地区环状病毒进行比较,为全面认识西藏地区环状病毒的特点和进一步确切分类提供依据。方法：将病毒平行接种ＢＨＫ１３、Ｖｅｒｏ、Ｃ６／３６、ＨｅＬａ４种细胞,逐日观察病毒的致细胞病变效应（ＣＰＥ）,特异荧光发生部位和细胞数量,超薄切片电镜观察病毒的形态发生以及进行ＴＣＩＤ５０滴定。结果与结论：Ｔｉ３０１０环状     

抗前列腺干细胞抗原鼠单克隆抗体的制备及其初步鉴定

目的:制备抗前列腺干细胞抗原鼠单克隆抗体(mAb).方法:采用杂交瘤技术,获得了10余株针对前列腺干细胞抗原(PSCA)的鼠mAb杂交瘤细胞株,对其中的6株进行了相关鉴定.结果:6株mAb的腹水效价均达到 1: 512 000,将其中的两株mAb进行了纯化,纯化后纯度大于90%,抗体亚类(型)mAb1、 mAb26为 IgG2b/k型,mAb6、 mAb11、 mAb37 为IgG1/k型,mAb46为 IgG2a/k型;ELISA结果显示制备的mAb与PSCA可发生特异反应.结论:制备了抗前列腺干细胞抗原鼠mAb,为PSCA生物学功能的研究打下基础.     

西藏亚东、错那地区人群携带虫媒病毒抗体的流行病学调查

西藏亚东、错那地区人群携带虫媒病毒抗体的流行病学调查杨秀旭，代晓红，黄祥瑞，吴庆丽，程聪，张启恩（军事医学科学院微生物学流行病学研究所北京１００８５０）西藏亚东和错那地区处于我国西南边陲，除有终年积雪的高寒山地外，还有森林密布、杂草丛生的灌木丛，地形...     

人神经生长因子在CHO细胞中的高效稳定表达

神经生长因子 (nervegrowthfactor,NGF)是神经系统重要的营养因子[1 ] 。NGF的主要生物学效应是维持外周交感、感觉神经元和中枢胆碱能神经元的存活和发育 ,促进神经系统损伤后修复 ,同时还参与调节免疫和造血等非神经系统的功能[2 ] 。NGF在治疗神经损伤、早老性痴呆和外周神经病等方面具有广阔的临床应用前景[3] 。基因工程方法是获得人神经生长因子 (hNGF)的重要手段之一 ,大肠杆菌表达的hNGF ,其体外折叠困难 ,复性后的蛋白生物比活性低。而在哺乳动物细胞中可产生具有较高生物学活性的类似天然蛋白的人神经生长因子。国内尚未有h…     

炭疽毒素保护性抗原和LFn介导的增强型绿色荧光蛋白进入HeLa细胞的研究

目的 研究炭疽毒素保护性抗原(protective antigen,PA)和致死因子(lethal factor,LF)N端254个氨基酸(LFn)在辅助增强型绿包荧光蛋白(EGFP)进入细胞中的作用.方法 分别扩增炭疽毒素的基因片段和EGFP的基因全长,将两片段先后克隆至pET-21a(+),构建成重组表达质粒pET-LFn-EGFP,在大肠杆菌中诱导表达,并对融合蛋白LFn-EGFP进行纯化.利用荧光共聚焦显微镜和流式细胞术研究LFn-EGFP融合蛋白进入细胞的情况.结果 获得较高纯度的融合蛋白LFn-EGFP,纯度可达90%以上,体外实验显示该融合蛋白保留了LFn与PA结合的活性,并且能够进入到HeLa细胞中.结论 LFn-EGFP蛋白本身也会以未知的机制进入细胞,在PA辅助时,LFn-EGFP进入细胞的效率会有所增加.     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的克隆、表达、纯化及生物学活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的可溶性片段（soluble TNF-related apoptosis-inducing Ligand，sTRAIL），并鉴定其生物学活性。方法：以人胎盘cDNA为模板，根据GenBank中序列NM_003810设计引物，以PCR方法扩增sTRAIL基因，将其克隆人pET-32a，转化BL21（DE3），IPTG诱导后，收集菌体，超声破碎，离心取上清纯化，鉴定其生物学活性。结果：表达载体经DNA测序鉴定，氨基酸序列与预期一致。宿主菌高效表达目的蛋白，经SDS-PAGE、氨基酸测序鉴定均正确。可溶部分占表达总量的20％。经过两步纯化，sTRAIL纯度达到95％，表达量可达20mg／L培养基。纯化产物在体外能够明显诱导L929、NCI157、BEL7402、DU145等细胞凋亡，Hela细胞不敏感。对于L929，其半数致死量为0．10μg／ml。结论：本研究在原核表达系统中表达了sTRAIL，获得高纯度sTRAIL蛋白，为其进一步研究提供了良好基础。     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6对小鼠巨噬细胞凋亡的诱导作用

【目的】研究结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）分泌蛋白ESAT-6（early secreted antigenic target of 6 kD）对小鼠巨噬细胞凋亡的影响及机理。【方法】应用流式细胞仪分析稳定表达ESAT-6和经重组ESAT-6蛋白作用的小鼠RAW264.7细胞的凋亡;应用Caspase-3检测试剂盒检测caspase-3活性变化;进一步应用Western blotting分析稳转细胞系ESAT-6表达情况。【结果】RAW-EGFP-ESAT-6细胞系培养48 h后的凋亡率与caspase-3活性显著高于RAW264.7和RAW-EGFP细胞系（P〈0.05）;RAW-flag-ESAT-6细胞系培养48 h后的凋亡率与caspase-3活性显著高于RAW264.7和相应对照细胞系（P〈0.01）。10μg/ml重组ESAT-6可显著诱导RAW264.7细胞凋亡,而5μg/ml重组ESAT-6无明显诱导细胞凋亡效果。稳转细胞系RAW-flag-ESAT-6细胞内flag-ESAT-6浓度大约只有500 ng/ml。【结论】胞内低水平表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6可依赖caspase-3信号通路诱导小鼠RAW264.7细胞凋亡。     

福建省环状病毒感染的血清学检测及临床意义探讨

目的 探讨福建省人群环状病毒的自然感染状况及临床上具有发热、关节痛、皮疹等症状患者之间的关系。方法 采用间接免疫荧光试验（ＩＦＡ）对２０２株林区正常人血清及１２６例病人血清或脑脊液进行环状病毒ＩｇＧ和ＩｇＭ抗体检测,以北京地区２０例健康人血清为对照。结果 ２０２例林区正常人血清中环状病毒ＩｇＧ抗体阳性率为３５．６％（７２／２０２）,１２６例病人血清或脑脊液中ＩｇＧ抗体阳性率为３１．７％（４０／１