DNA双链断裂残留损伤与癌细胞辐射敏感性研究

目的 了解不同组织来源癌细胞株和人体肿瘤组织原代细胞的DNA双链断裂损伤修复的个体差异性,探寻预测癌细胞辐射敏感性的生物指标。方法 ⁶⁰Co γ射线照射诱发DNA损伤,脉冲电场凝胶电泳检测DNA双链断裂损伤修复,细胞克隆形成能力法检测细胞辐射敏感性。结果 8个不同组织来源癌细胞株的辐射敏感性有较大的差异(D₀为0.65~2.15 Gy),不同细胞株20 Gy γ射线照射诱发产生的DNA双链断裂原初损伤有一定的差别,但与细胞辐射抗性无相关性。辐射敏感细胞SX-10的DNA双链断裂修复缺陷发生在早期快速修复相,而A2780细胞的修复缺陷是发生在晚期慢速修复相。20 Gy照射修复2 h后DNA双链断裂残留量与细胞辐射敏感性指标D₀或SF₂值有显著的相关性。不同个体患者脑肿瘤组织原代细胞之间,辐射诱发DNA双链断裂的修复反应存在明显差异,修复2 h后残留损伤的个体差异性分布类似于癌细胞株。结论 DNA双链断裂残留损伤与癌细胞辐射抗性有显著相关性,可作生物指标预测肿瘤组织细胞对放射治疗的反应性。     

人DNA修复基因研究进展

DNA分子损伤的修复系统颇为复杂,参与此过程的复合物和其遗传控制位点非常之多,进行修复基因的克隆研究是深刻认识DNA损伤修复分子机理必不可少的途径。一些人类遗传性疾病与DNA修复基因的缺陷有着直接联系,而且现在人们已经展开了基因治疗这一重大课题研究,因此分子克隆人的DNA修复基因也有重要的实际意义。由于细菌与酵母的基因组结构简单,过去对损伤修复机理研究多以它们为对象,对其     

三氟拉嗪诱发细胞凋亡及对DNA依赖蛋白激酶催化亚单位表达和P38磷酸化的抑制作用

目的　探讨三氟拉嗪(TFP)对肿瘤细胞生长的抑制作用和分子机制,寻找抑制肿瘤生长的作用靶分子。方法　用不同剂量TFP作用于人宫颈癌上皮细胞(HeLa) ,体外细胞计数绘制生长曲线;荧光染料染色及DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;γ射线及TFP处理细胞观察TFP对细胞辐射敏感性的影响;Western印迹分析蛋白表达或磷酸化。结果TFP作用后HeLa细胞的生长受到抑制,对γ射线的敏感性增加,且随着剂量的增加细胞凋亡的比率也增加。TFP还可有效诱导DNA修复蛋白DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)被切割,且可抑制辐射诱发的P3 8的磷酸化。结论　TFP可抑制肿瘤细胞的生长,对DNA-PKcs的表达和P3 8的磷酸化都有抑制作用     

人IER5基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

目的：利用昆虫杆状病毒表达系统表达早期快速反应基因5（IER5）蛋白,为后续蛋白质结晶及探索蛋白质三级结构提供线索。方法：以HeLa细胞cDNA为模板扩增出IER5基因片段,构建重组转移质粒pFastBac1-IER5;重组转移质粒经双酶切及测序鉴定后转化至感受态细胞DH10Bac,以获得重组的穿梭质粒rBacmid-IER5;将重组穿梭质粒感染Sf9细胞,待细胞出现明显病变时收集重组杆状病毒;用间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western blot以及对表达产物进行分析鉴定。结果：重组转移质粒pFastBac1-IER5经双酶切后得到与预期相同的2条条带;重组穿梭质粒rBacmid-IER5经PCR鉴定在3 300 bp左右出现一条特异性条带;间接免疫荧光结果提示IER5蛋白在Sf9细胞中得到表达;SDS-PAGE结果显示,表达产物的相对分子质量约为48 k,Western blot结果表明表达产物能与IER5抗体特异性结合。结论：利用昆虫-杆状病毒表达系统成功表达了人IER5蛋白,获得了体外表达重组IER5蛋白的相对分子质量、溶解性等物理化学特性。     

60Co γ射线对盐诱导激酶2的诱导表达作用

目的 探讨电离辐射对盐诱导激酶2（SIK2）蛋白和mRNA的诱导表达作用及细胞周期相关性。方法 HepG2细胞用⁶⁰Co γ射线照射,蛋白质印迹法和实时定量PCR法分别检测细胞的SIK2蛋白和mRNA的表达,胸腺嘧啶双阻滞法同步化细胞,流式细胞术测定细胞周期的变化。结果 HepG2细胞2 Gy照射后4、6、10 h,SIK2蛋白表达显著增加 （t=3.00、3.98、4.17,P<0.05）;10 Gy大剂量照射后,SIK2蛋白表达增加的趋势与2 Gy一致,但增加的幅度较前者低。2和10 Gy照射后SIK2基因 mRNA均在10 h出现了增加（t=4.54、2.74,P<0.05）。照后10 h出现了细胞G₂/M阻滞高峰。利用同步化细胞分析表明,细胞周期不同时相中SIK2 mRNA的表达无明显差别。结论 2和10 Gy照射均能诱导SIK2蛋白表达增加,2 Gy的作用更加明显。细胞照射后10 h,SIK2 mRNA的表达水平增加,但与辐射诱发细胞G₂/M期阻滞引起不同时相细胞的分布变化无关。     

hape反义核酸的构建及其对细胞辐射效应的影响

目的克隆人ＡＰ内切核酸酶基因（ｈａｐｅ）ｃＤＮＡ全长编码序列,研究ｈａｐｅ反义核酸对细胞辐射敏感性和Ｈ２Ｏ２细胞毒的影响。方法反转录ＰＣＲ克隆人ｈａｐｅｃＤＮＡ,应用基因重组技术构建真核反义表达载体,用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ介导基因转染,细胞克隆形成法分析细胞存活。结果从人胚肺（ＨＥＬ）细胞中克隆出ｈａｐｅｃＤＮＡ全长编码序列,构建了ｈａｐｅ的真核反义表达质粒ｐＣＩＮ／ＡＳｈａｐｅ并转染ＨＯＣ８细胞,研究表明ｈａｐｅ反义核酸,提高了ＨＯＣ８细胞对γ射线和Ｈ２Ｏ２损伤的敏感性。结论利用分子生物学技术手段,阻断细胞ＤＮＡ修复过程中的某一环节,是细胞辐射或化疗药物增敏的一种有效途径。     

脉冲电场电泳系统的发展及在大DNA分子研究中的应用(文献综述)

脉冲电场凝胶电泳是近年发展起来的一种新技术,用于分离常规电泳所不能分离的大 DNA 分子,本文介绍了这种电泳系统的发展类型和特点、影响参数以及在大DNA 分子研究中的应用。     

放射损伤细胞中高尔基体弥散现象及香兰素衍生物的防护作用

目的：通过观察辐射对高尔基体形态的影响,确定香兰素衍生物VND3207对受照细胞高尔基体的防护作用。方法采用免疫荧光技术检测放射损伤细胞中高尔基体弥散现象并统计弥散面积,检测细胞周期变化,分析细胞存活率,同时对高尔基体蛋白的表达水平进行检测。结果免疫荧光检测结果显示,照射后高尔基体的弥散面积增加,具有一定的剂量效应和时间效应;VND3207能减轻γ射线对高尔基体的损伤,其表现为与未加药组相比,在抑制不同剂量照射后可使高尔基体弥散面积增加;细胞周期测定结果显示,4 Gy γ线照射后G2／M期阻滞峰值约出现在12 h后;免疫印迹结果显示DNA损伤引起的G2／M期阻滞也在12 h后解除;而高尔基体弥散在细胞周期阻滞解除后12和24 h仍然存在;平板克隆结果显示,VND3207促进了受照细胞的存活。结论放射损伤能引起剂量依赖性高尔基体弥散效应,且这种弥散与DNA损伤诱导的周期阻滞无关,VND3207对放射损伤引起的高尔基体弥散有一定的抑制作用,可能与受照细胞受到保护有关。     

GCF低表达宫颈癌HeLa细胞系的构建及辐射对其调控IER5基因表达的初步探究

目的 构建GCF低表达的宫颈癌HeLa细胞系,在⁶⁰Co γ射线照射下初步探究其细胞增殖以及调控宫颈癌放射敏感基因IER5的表达。 方法 经带有荧光标记的GCF低表达的质粒稳定转染HeLa细胞, G418筛选,蛋白印迹法、实时定量PCR法鉴定得到GCF-shRNA-HeLa单克隆细胞系。倒置显微镜观察细胞形态变化,CCK-8法探究不同剂量照射后的细胞增殖情况,在不同照射剂量下用蛋白印迹法检测GCF-shRNA-HeLa及对照细胞中IER5蛋白的表达情况。 结果 成功构建稳定表达的GCF-shRNA-HeLa单克隆细胞系,显微镜下观察GCF-shRNA-HeLa细胞比正常HeLa细胞体积小,细胞间隙较大,其中梭形细胞较多。蛋白印迹法及实时定量PCR验证了GCF-shRNA-HeLa的蛋白表达及mRNA转录水平均低于对照组(P<0.05)。辐射情况下实验结果显示在同一照射剂量、同一时间下GCF-shRNA-HeLa细胞比control对照细胞增殖缓慢(P=0.014)。不同剂量照射情况下蛋白印迹法检测HeLa细胞、control-shRNA-HeLa与GCF-shRNA-HeLa细胞IER5蛋白表达情况,结果同一辐照剂量下GCF沉默的细胞系中IER5的表达量比对照细胞高, 4Gy照射的GCF-shRNA-HeLa的IER5表达量最高(P<0.05)。 结论 本实验构建了低表达GCF的HeLa细胞系,初步探讨GCF作为IER5基因抑制性转录因子的作用。结合临床基因靶向治疗,可寻求可以降低GCF表达的方式,通过上调IER5表达这一双效途径来加速宫颈癌细胞凋亡。