α_1-抗胰蛋白酶活性测定方法及其影响因素的研究

目的研究用发色底物法测定α1-AT生物活性时,以正常人混合血浆为参考标准的血浆稀释度范围和测定的影响因素。方法采用酶标仪测定抗胰蛋白酶与过量的胰蛋白酶反应后,剩余的胰蛋白酶与BAPNA发色反应的OD值(405nm),观察时间和温度对反应的影响,优化正常人混合血浆(30人份)稀释度范围,建立并验证血浆标准曲线,同时观察几种物质对测定的影响。结果通过优化实验,血浆的稀释倍数在1/50~1/100之间有良好的线性;PEG4000、蔗糖、Tween80/TNBP(S/D)、辛酸钠等对活性测定无明显影响,而枸橼酸钠浓度>0.125mol/L,α1-AT生物活性测定结果偏高约20%。结论以正常人混合血浆为参考标准品,用酶标仪测定α1-AT的生物活性,快速、准确,方法稳定可靠,α1-AT制备过程中常用的几种物质,除枸橼酸钠外,对其活性测定均无影响。     

小儿医源性急性骨髓放射病的临床特点

我们在开展小儿骨髓移植、胎肝移植的予处理时使用了致死量~(60)Coγ线照射。本文就照射后放射病的临床特点,血液、骨髓、肝肾功能及免疫功能进行分析,以便了解小儿急性放射病的特点。 一、病人及照射情况 本组4例中男3例、女1例,年龄2 2/12～6岁,病例1～3诊断为重症β地中海贫血,病例4为慢性粒细胞型白     

重组人蛋白C在CHO/dhfr+细胞中的表达与分析

目的 :人蛋白C具有重要的抗凝功能 ,与复发性血栓性疾病、蛋白C缺陷症、创伤等有重要关系。血源蛋白C成本高、工艺复杂且存在纯度、稳定性、安全性等问题 ,研制重组人蛋白C具有必要性。目前尚无此类产品上市。本研究拟从人肝细胞中克隆蛋白C的cDNA ,构建人蛋白C的哺乳动物细胞表达载体 ,实现重组人蛋白C在CHO dhfr 中的表达。方法 :用RT_PCR从人胎肝细胞mRNA中扩增人蛋白C的全长cDNA片段 ,将之克隆入pGEM_T载体并测序。目的片段插入真核表达载体pIRESneo以构建重组表达质粒。磷酸钙共沉淀法转染CHO dhfr 细胞 ,G4 18筛选抗性克隆。Western印迹法检测细胞培养上清。HitrapQ进行色谱纯化。表达产物经蛙蛇蛇毒激活后以APTT法测定抗凝活性。结果 :RT_PCR扩增到长 1386bp的DNA片段 ,序列与已报道的人蛋白C一致。所构建的表达质粒pIREShPC转染CHO dhfr 细胞 ,经G4 18加压筛选得到 7株表达细胞。Western印迹法检测发现表达产物能与抗人蛋白C单克隆抗体结合 ,相对分子质量与人蛋白C一致。HitrapQ纯化重组蛋白回收率 >6 0 %。表达产物抗凝活性略低于天然人蛋白C。     

乙醇醛聚合牛血红蛋白对失血性休克复苏效果的初步研究

目的 观察乙醇醛聚合牛血红蛋白对失血性休克大鼠的复苏效果。方法 建立一种以碱缺水平为标准的大鼠失血性休克模型２４只，随机分为对照组、全血组、乳酸化林格液组和聚合牛血红蛋白组，每组６只。对照组不进行复苏，其他各组根据大鼠出血量采用对应液体进行复苏，并观察各组大鼠休克末和输液后各时相点的血压、心率、体温及血气。结果 聚合牛血红蛋白复苏效果从某些指标观察与全血相似；有些指标优于全血组，如输液后４５ｍｉｎ     

人抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)在巴斯德毕赤酵母中表达与纯化

目的 :在巴斯德毕赤酵母中进行表达及纯化AT Ⅲ ,以对其功能进行深入研究。方法 :将携带AT Ⅲ基因的表达载体电转染GS115细胞 ,用G4 18筛选抗性克隆 ,SDS PAGE与Western印迹检测及鉴定表达产物 ;采用生化法测定AT Ⅲ的表达量 ;利用凝血酶空斑法测定表达产物活性 ,经过Heparin hyperD柱纯化。结果 :Western印迹分析发现转移至膜上的表达产物能与抗AT Ⅲ单克隆抗体结合 ,证明成功地表达了AT Ⅲ ,纯度 >95 %。活性测定表明表达产物具有天然AT Ⅲ的生物活性。结论 :在巴斯德毕赤酵母中成功地表达与纯化AT Ⅲ ,得到同天然蛋白相似的比活性人AT Ⅲ。     

B区缺失型人FⅧ在酵母中的表达尝试

目的　尝试B区缺失型FⅧ在毕赤酵母 (P .pastoris)中的表达 ,探索rFⅧ在酵母中的表达情况和可能性。方法　将B区缺失型FⅧcDNA与质粒载体 pPICZaA酶切、连接 ,构建了酵母表达载体 pPICZα FⅧ ,电击转染GS115酵母细胞 ,甲醇诱导表达 ,一步法对表达产物进行活性检测并进行Dot Blot及Western Blot分析。结果　随着发酵时间的延长 ,表达产物的凝血时间越来越长 ,而蛋白表达量越来越高。结论　rFⅧ在酵母中的表达产物不稳定 ,表达水平较低 ,表达方法须改进     

辛酸钠对α1-抗胰蛋白酶制剂病毒灭活的初探

目的研究辛酸钠在α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)病毒灭活中的应用,确定保护剂和灭活的条件,并在最大限度保护α1-AT活性的条件下,对病毒灭活效果进行检测。方法室温(25℃左右)条件下,在α1-AT溶液中加入不同的保护剂,加入0.3%的辛酸钠,调节pH至5.38、5.50、5.60,分别在不同的孵育时间观察α1-AT活性的变化;对选定的灭活条件,用辛德毕斯病毒(Sindbis virus)和伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)进行灭活验证。结果纯化的α1-AT样品加入40%蔗糖和2%白蛋白作为保护剂,加入0.3%辛酸钠,pH5.60±0.02,5min内Sindbis病毒和PRV各下降>5LogTCID50,1h内α1-AT活性下降<10%。结论辛酸钠在酸性条件下,可以灭活α1-AT制剂中的脂包膜病毒。     

亚甲基蓝／光化学法灭活血浆中指示病毒及对血浆？…

目的 探讨亚甲基蓝光化学法灭活血浆中模型病毒的效果。方法 用ＶＳＶ－Ｉｎｄｉａｎａ株作为指示病毒。接种于Ｖｅｒｏ单层细胞中,孵育３９℃２４ｈ用微量细胞病变法,进行病毒滴定。并用小量试验观察病毒灭活效果及对血浆蛋白的影响。结果 亚甲基蓝（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ ＭＢ）结合可见光照射可有效灭活血浆中的指示病毒,极低浓度的染料加光照可完全灭活血浆中大于６ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０的水泡性口膜炎病毒（Ｖ     

聚合牛血红蛋白抗原性的初步研究

目的 研究乙醇醛聚合的牛血红蛋白的抗原性。方法 （１）将聚合的牛血红蛋白按免血量的１０％和２０％分别输入兔耳缘静脉,免疫多次,ＥＬＩＳＡ检测抗体。（２）将聚合的牛血红蛋白、人血红蛋白和兔血红蛋白分别与免疫佐剂混合,按常规免疫家兔,并以上述３种抗原分别包不同的聚乙烯板,ＥＬＩＳＡＳ检测每一种怕与３种抗体交叉反应滴度。结果 聚合牛血红蛋白和人血红蛋白均产生抗体交叉且有交叉反应。结论这两种血红蛋白可能有