人脑胶质瘤多药耐药细胞株的构建及生物学特性鉴定

目的 体外构建胶质瘤耐甲磺酸伊玛替尼多药耐药细胞株,并研究其生物学特性。方法采用逐渐增加培养基中伊玛替尼药物浓度的方法诱导构建耐甲磺酸伊玛替尼的人脑胶质瘤U251细胞株(命名为U251 AR); CCK8法检测U251AR、U251对多种化疗药物的IC50和耐药指数;QRT-PCR法检测耐药相关基因ABCC1、A BCB1、A BCB4、A BCG2 mRNA的表达,流式细胞术检测ABCG2蛋白的表达。 结果 体外培养12个月后建立了稳定耐药的细胞株U251AR,与亲代细胞相比异形性不显著。U251和U251AR对化疗药物的IC50相比较差异均有统计学意义（P＜0.05）,U251AR对甲磺酸伊玛替尼、阿霉素、顺铂的耐药指数分别为20.41、5.06、10.28,表现出多药耐药特征。QRT-PCR检测结果显示耐药细胞株U251AR中ABCC1、ABCB1、ABCB4、ABCG2 mRNA的表达明显高于亲代U251细胞,流式细胞术检测结果显示U251AR中ABCG2蛋白的表达强于亲代U251细胞,差异均有统计学意义(P＜0.05)。 结论 成功建立多药耐药的胶质瘤细胞株U251AR,其多药耐药与A BCC1、A BCB1、A BCB4、A BCG2 mRNA及ABCG2蛋白的表达上调相关。     

MiR-126体外调控人脐静脉内皮细胞中表皮生长因子-7基因的表达

目的 研究miR-126对类表皮生长因子域7(EGFL-7)基因表达的调控作用.方法 设计并构建靶向于EGFL-7的miR-126表达质粒,用脂质体转染人脐静脉内皮细胞株ECV-304,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Westernblotting检测EGFL7的mRNA及蛋白表达水平.结果 用miR-126重组质粒转染ECV-304后经qRT-PCR检测发现:转染后pEGFP-N1-GFP/miR-126转染组EGFL7mRNA平均表达水平随时间总体呈降低趋势,48h的表达量最低.Western blot检测发现:重组质粒转染后plegfp-N1-miR-126转染组内皮细胞中EGFL7蛋白相对于β-actin的比率为0.111,相对于空白对照组(0.336)减少了67%,而空质粒转染组(0.314)相对于空白对照组仅减少了6.5%.结论 MiR-126可下调内皮细胞中EGFL-7蛋白水平的表达,为下一步研究EGFL7与肿瘤血管发生机制之间的关系提供了实验依据.     

miR-34a 通过Snail 诱导肺癌EMT 及促进其转移的分子机制

目的:探讨miR-34a 在肺癌组织中的表达情况以及miR-34a 在肺癌细胞侵袭和迁移过程中的作用及其机制。方法:qPCR 检测肺癌和正常肺组织中miR-34a 的表达情况;使用miR-34a-mimic 和miR-34a-inhibitor 过表达和沉默miR-34a,qPCR 检测沉默和过表达效果;Western blot 检测沉默和过表达miR-34a 后Snail 蛋白的表达情况;荧光素酶报告基因检测miR-34a 与Snail 的相互作用;Transwell 侵袭实验检测miR-34a 的表达对肺癌细胞侵袭能力的影响;划痕实验检测miR-34a 的表达对肺癌细胞迁移能力的影响;Western blot 检测E-Cadherin、Vimentin 和Twist 蛋白的表达情况。结果:与正常肺组织相比,肺癌组织中miR-34a 表达明显降低;且晚期、低分化和有淋巴结转移的肺癌组织miR-34a 表达明显较早期、高分化和无淋巴结转移的肺癌组织低;miR-34a-mimic miR-34a-inhibitor 可以有效抑制和过表达miR-34a 的表达;miR-34a 能与Snail 的3忆UTR 特异性结合;miR-34a 可以调控肺癌H1650 细胞的侵袭迁移能力;过表达miR-34a 上调E-Cadherin,同时下调Vimentin 和Twist 蛋白的表达,沉默miR-34a 则相反。结论:miR-34a 在肺癌中表达明显降低,且跟肺癌分期分级以及淋巴结转移与否密切相关,同时miR-34a 可以通过上皮间质转化调节肺癌细胞侵袭和迁移能力。     

紫苏醇对肺癌A549 细胞增殖和侵袭的抑制作用机制的研究

目的:探讨紫苏醇(Perillyl alcohol,PA)对肺癌A549 细胞增殖和侵袭的抑制作用机制,并阐明其对肿瘤血管生成信号的影响。方法:不同浓度PA 和厄洛替尼加入到A549 细胞中,利用溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)法测定药物组对A549 细胞的抑制作用,Transwell 法检测PA 对A549 细胞侵袭的抑制作用,采用间接荧光标记法测定细胞内活性氧(ROS)水平的变化;分光光度法检测PA 对细胞凋亡蛋白Caspase-3 活性的影响,Western blot 法检测A549 中VEGF、HIF-1 及COX-2 的表达,凝胶迁移或电泳迁移率实验测定A549 细胞中NF-κB 活性。结果:与空白对照组比较,随着浓度的增加(10、50、100 g/ ml),PA 和厄洛替尼对A549 细胞生长的抑制率在不断地增加,差异均有统计学意义(P<0.05),A549 细胞侵袭能力呈现不断下降的趋势,差异均有统计学意义(P<0.05),A549 细胞内活性氧水平随厄洛替尼浓度的增加变化不大,而ROS 水平随着PA 的浓度的增加而增加,在100 g/ ml 浓度的PA 下引起的ROS 百分率达到了(80.43±6.92)%,差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞活力检测结果显示,随着PA 和厄洛替尼浓度的增加和作用时间的延长,A549 细胞中凋亡蛋白Caspase-3 活性明显增加(P<0.05),随着紫苏醇浓度的增加,COX-2、VEGF 和HIF-1 的表达呈不断降低的趋势,EMSA 检测结果显示,随着PA 浓度的增加,NF-κB 的条带面积不断减少。结论:PA 可能参与并促进了ROS 的生成和Caspase-3 活性增加,最终诱导A549 细胞的凋亡,PA 可能通过降低NF-κB 的表达,进而诱导COX-2、VEGF 等的表达减少,使血管生成滞后,能够有效地使细胞的穿透能力下降和凋亡发生。     

上调Delta-Like1基因可增强小细胞肺癌化疗敏感性

背景与目的 DLL1(Delta-Like1)与Notch受体结合激活Notch信号通路,从而决定细胞的分化,并调控多种组织的生长发育。已有研究报道DLL1与肿瘤的生长、分化密切相关。前期基因芯片发现DLL1与小细胞肺癌的耐药性相关,本研究旨在进一步探讨DLL1在小细胞肺癌多药耐药中的作用。方法首先通过QRT-PCR和Western blot从基因和蛋白水平检测化疗敏感细胞株H69及多药耐药细胞株H69AR中DLL1的差异表达;转染DLL1-pIRES2-EGFP表达质粒上调H69AR细胞中的DLL1的表达,构建稳定转染的过表达细胞株H69AR-eGFP-DLL1,通过CCK8检测细胞对各种化疗药物(ADM,DDP,VP-16)的敏感性变化,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡的变化。结果 DLL1在化疗敏感细胞H69中的表达明显高于H69AR,过表达H69AR中DLL1的表达能够增加细胞对化疗药物的敏感性,促进细胞的凋亡,细胞周期发生G0/G1期及S期阻滞,上调DLL1增加其下游基因HES1、HEY1的表达。结论在小细胞肺癌中上调DLL1的表达可能增加细胞对化疗药物的敏感性,DLL1通过肿瘤细胞间的相互作用激活HES1、HEY1等下游基因,影响小细胞肺癌的多药耐药。     

一种新的肿瘤干细胞球囊研究技术——蛋清包埋技术

目的 探索一种新的能长期、高效保存并研究肿瘤干细胞球囊的技术.方法 从恶性胶质瘤原代肿瘤细胞中培养出肿瘤干细胞.将第5代肿瘤干细胞球囊经蛋清石蜡两次包埋、切片后,行HE染色、免疫组织化学染色和免疫组织荧光染色,并与传统的肿瘤干细胞球囊包埋技术及球囊免疫组织荧光染色实验进行比较.结果 应用蛋清石蜡两次包埋处理的球囊切片经HE染色后,球囊分布均匀、结构完整,胞核、胞浆颜色鲜艳、对比度高.球囊切片的免疫组织化学染色和免疫组织荧光染色能准确定位球囊中阳性细胞和阳性蛋白表达位点,可进行阳性细胞及蛋白的半定量分析.结论 肿瘤干细胞球囊蛋清石蜡两次包埋切片技术能提高实验效率,减少实验误差,节省成本,优于传统球囊包埋技术及传统球囊免疫荧光技术.     

红景天苷下调组织蛋白酶B和NF-κBp65水平改善大鼠肺纤维化

目的：探讨红景天苷改善大鼠肺纤维化的相关机制。方法：SD大鼠随机分为空白组、肺纤维化模型组、 吡非尼酮组和红景天苷高剂量组、中剂量组、低剂量组。测定6组肺系数,血气分析,检测肺泡灌洗液中白蛋白 (ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、乳清脱氢酶(LDH)含量,肺组织羟脯氨酸(HYP)含量,血清III型前胶原(PC-III)和IV型胶 原(COL4)含量,溶酶体组织蛋白酶B(cathepsin,CB)和NF-κBp65表达的水平。结果：模型组肺系数明显高于空白组 (P<0.05),而氧分压明显低于空白组(P<0.05);吡非尼酮组、红景天苷高、中、低剂量组肺系数相比模型组均下降 (P<0.05),氧分压则升高(P<0.05)。模型组中ALB,ALP,LDH含量较空白组升高(P<0.05);随着红景天苷浓度的增 加,ALB,ALP,LDH呈下降趋势(P<0.05)。模型组谷胱甘肽(GSH)含量较空白组升高(P<0.05);随着红景天苷浓度 的增加,GSH含量呈下降趋势(P<0.05)。模型组肺组织中HYP及血清PC-III和COL4含量较空白组升高(P<0.05);随着 红景天苷浓度的增加,HYP及血清PC-III和COL4含量呈下降趋势(P<0.05)。模型组CB和NF-κBp65表达较空白组升高 (P<0.05);随着红景天苷浓度的增加,CB和NF-κBp65表达呈下降趋势(P<0.05)。结论：红景天苷能改善大鼠肺纤维 化,其机制可能与降低大鼠肺组织的CB和NF-κBp65的表达有关。     

LRIG1和 EGFR mRNA在非小细胞肺癌患者外周血中的表达及其临床意义

目的：观察非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血中LRIG1和EGFR mRNA表达水平,并分析其与患者临床病理特征的关系,为NSCLC的治疗提供依据。方法：采用实时荧光定量PCR法分析69例NSCLC患者外周血单个核细胞中LRIG1和EGFR mRNA表达水平,并分析其与患者的肿瘤临床分期、性别、年龄及生存期的关系。结果：与正常人比较,NSCLC患者外周血中LRIG1 mRNA的表达水平降低, EGFR mRNA的表达水平增高,差异具有统计学意义（P<0.001）;LRIG1和EGFR mRNA的表达水平与患者性别、年龄及组织来源无关联(P>0.01 ),与患者肿瘤临床分期及生存期有密切关联(P<0.001);Cox回归分析,肿瘤临床分期、LRIG1和EGFR mRNA的表达水平可作为独立的预后因子;肿瘤临床分期越晚,患者预后越差（P=0.028）,相对风险度（RR）= 1.548,95%可信区间(95% CI)为1.074～2.283;LRIG1 mRNA的表达水平越高,患者预后越好（P= 0.026）,RR=0.242,95%可信区间为0.069－0.843;EGFR mRNA表达水平越高,患者预后越差（P=0.027）,RR= 3.732,95%CI为1.165～11.956。高表达LRIG1患者的生存时间长于低表达者（χ2 =56.560,P<0.001）;高表达EGFR mRNA患者生存时间短于低表达者（χ2 =51.962,P<0.001）。同一患者血液标本中LRIG1和EGFR 在mRNA表达水平呈负相关关系( r=－0.307,P=0.016)。结论：LRIG1通过负向调节EGFR的表达影响NSCLC患者的肿瘤临床分期和生存时间。LRIG1可能通过调节EGFR的表达影响NSCLC患者的疗效和预后。     

FZDl基因对小细胞肺癌多药耐药作用研究

目的：探讨FZDl在小细胞肺癌多药耐药中的作用。方法：运用QRT—PCR和蛋白质印迹法,分别从基因和蛋白水平检测小细胞肺癌敏感细胞株H69及耐药细胞株H69AR中FZDl的差异表达,同时运用QRT—PCR检测化疗敏感及耐药患者血液标本中FZDl的差异表达;采用siRNA抑制耐药细胞株H69AR中FZDl的表达,通过CCK8检测细胞对各种化疗药物（ADM,DDP,Vp-16）敏感性的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。结果：无论是基因水平还是蛋白水平,FZDl在H69AR细胞中的表达明显高于H69细胞,差异有统计学意义,P值分别为0．003和〈0．001;FZDl在化疗耐药患者血液标本中的表达较化疗敏感者明显增高,差异有统计学意义,P〈O．001。下调H69AR细胞株中FZDl的表达能够增加细胞对化疗药物的敏感性,差异有统计学意义,P=0．020;H69AR细胞组的凋亡率为（2．037土0．49）％,较H69细胞组（9．63±0．67）％明显降低,差异有统计学意义,P=0．002。下调H69AR细胞中FZDl的表达后,H69AR—Si—FZDl组细胞的凋亡率为（17．093±0．904）％,明显高于空白对照H69AR及阴性对照H69AR—NC组的（2．25±0．967）％,差异有统计学意义,P=0．007。结论：FZDl参与调节小细胞肺癌的多药耐药,下调FZDl基因的表达能够增加细胞对化疗药物的敏感性,FZDl可能通过抑制细胞凋亡而影响小细胞肺癌的多药耐药。