P53和P21在PC12细胞分化中的作用

目的探讨P53及其下游P21蛋白在PC12细胞分化中的可能作用机制。方法用反转录病毒质粒pBabe-P53/m175转染未分化PC12细胞,经筛选后建立野生型P53蛋白功能丧失的细胞系PC12(P53/m175);利用倒置相差显微镜、流式细胞术及Western blot等方法,比较两种细胞在神经生长因子(NGF)作用后,细胞分化表型、细胞周期及相关蛋白表达的改变。结果NGF作用于正常PC12细胞组,P53/P21蛋白表达持续升高,细胞G1期阻滞出现的时间与蛋白表达开始增加的时间相一致;而在NGF作用的PC12(P53/m175)细胞组,细胞不能表达P21蛋白,且细胞周期G1期阻滞的程度也出现显著下降。NGF作用下,两组细胞都能观察到神经突起的生长,表现出明显的分化表型。结论PC12细胞经NGF作用后出现P53及P21蛋白持续表达增加,主要介导了细胞分化过程中细胞周期G1期阻滞这一特征的出现,但并不是导致神经突起进行性生长这一特征的必需条件。     

乙酰胆碱酯酶抑制剂他克林和多奈哌齐抗星形孢菌素致凋亡作用的比较

目的用星形孢菌素(STS)诱导NG108-15和HeLa细胞凋亡,观察他克林和多奈哌齐是否具有抗凋亡作用。方法MTT测定分析细胞损伤状况;相差显微镜和Hoechst 33342染色观察细胞及胞核形态;DNA提取及琼脂糖凝胶电泳观察凋亡特征性梯带;免疫印迹分析Bcl-2和Bax的表达水平。结果经0.1 mmol·L^-1他克林预处理后,由STS诱导的NG108-15细胞凋亡受到明显抑制。多奈哌齐预处理无保护作用。免疫印迹表明他克林可显著抑制Bax的表达,同时还可促进Bcl-2的表达。多奈哌齐和他克林预处理对STS诱导的HeLa细胞损伤无明显的保护作用。结论 他克林的抗凋亡作用与AChE抑制作用似乎没有明显关联。他克林对STS损伤的保护作用有细胞选择性。     

ERK在NGF诱导PC12 细胞分化中的作用

目的探讨细胞外信号调节激酶(ERK)在NGF。诱导的PC12细胞分化中的作用机制。方法以NGF处理PC12细胞建立分化模型,运用免疫印迹检测不同浓度不同作用时间时NGF对ERK1／2蛋白和磷酸化ERK1／2蛋白水平的影响,并观察MAPK／ERK激酶(MEK)抑制剂U0126对NGF诱导的细胞形态学改变的影响。结果ERK1／2蛋白的磷酸化呈现NGF剂量和时间依赖性。NGF作用细胞5min即可观察到明显的ERK1／2蛋白磷酸化,持续1h左右,2h时降低到初始水平,而细胞形态的改变出现在NCF作用12h以后。倒置相差显微镜观察可见PC12细胞分化的程度与ERK1／2活化持续的时间正相关,U0126可完全即时抑制ERK1／2的活化,而ERK1／2活化的抑制可完全阻断。NGF诱导的PC12细胞分化。结论ERK1／2的活化是PC12细胞发生分化的必需事件,其活化时间的长短对分化具有决定作用。     

发育、成年及老年期大鼠脑中Cdk5,p35,p39的表达及Cdk5激酶活性变化

目的 研究不同发育时期大鼠脑中Cdk5,p35,p39的表达及Cdk5激酶活性变化。方法 免疫印迹测定胚胎12天至出生后18个月大鼠脑中Cdk5,p35,p39的表达，通过测定Cdk5特定底物－组蛋白H1被磷酸化的程度检测鼠脑中Cdk5激酶活性。结果 从胚胎12天至出生7天，大鼠脑中Cdk5蛋白水平逐渐增加到峰值并保持于18个月龄。在胚胎12天时，Cdk5激酶活性和p35的蛋白水平较低，在胚胎18天至出生14天期间最高，然后在3个月龄至18个月龄的成年鼠和老年鼠脑中逐渐减少。与之相比，p39的表达方式与Cdk5和p35正好相反。自P14至18M龄鼠脑中，大脑皮质及海马的p35表达和Cdk5激酶活性高于小脑或纹状体。结论 大鼠发育早期，Cdk5激酶复合物的活化与神经发育密切相关，其生理作用在大脑皮质及海马有区域特异性。     

老年核性和皮质性白内障患者转化生长因子β2的表达及晶状体上皮细胞的变化

目的探讨老年人核性及皮质性白内障的发病机制.方法比较老年核性、皮质性白内障患者和健康人(对照组)晶状体上皮细胞(LECs)中转化生长因子β2(TGF-β2)mRNA、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2/Bax、纤维连接蛋白(FN)及波形蛋白的表达,并对晶状体上皮细胞的密度进行比较. 结果老年核性和皮质性白内障患者LECs中TGF-β2mRNA的表达量与β-actin的比值分别为0.16±0.02和0.27±0.01,与对照组0.15±0.02比较,差异有统计学意义(均为P＜0.05);两组PCNA蛋白的表达与内参的比值分别为16.01、1.98,与对照组2.43比较,差异有统计学意义(均为P＜0.05);两组Bax蛋白的表达与内参的比值分别为15.97、16.93,对照组为16.97;两组Bcl-2蛋白表达与内参的比值分别为6.97、1.44,与对照组的6.12比较,差异有统计学意义(均为P＜0.05);免疫组化结果显示,20张切片中,核性白内障组LECs中FN阳性为1张,波形蛋白阳性为2张;皮质性白内障组分别为19张、17张,两组比较差异有统计学意义(均为P＜0.05);核性和皮质性白内障组LECs密度分别为(5438.40±262.03)个/mm2和(4250.63±275.05)个/mm2,与对照组(5368.63±211.07)个/mm2比较,差异有统计学意义(均为P＜0.05).结论TGF-β2在老年人白内障发生的过程中起重要作用.老年人皮质性白内障的发生与LECs的凋亡、转化有关,而老年核性白内障患者LECs的增殖较活跃.     

他克林对星形孢菌素诱导NG108—15细胞凋亡的保护作用

目的：用星形孢菌素诱导NG108－15细胞损伤建立凋亡模型，观察乙酰胆碱酯酶（AChE)抑制剂他克林是否具有抗凋亡作用。方法：LDH活性测定判断细胞损伤状况，DNA染料Hoechst 33342染色观察细胞核形态，SDS－PAGE和Western blot印迹分析Bax及Bcl-2的蛋白表达水平。结果：NG108－15细胞经0．1μmol/L星形孢菌素处理24h，细胞内大量LDH释放至培养液中，用0．1mmol/L他克林预处理2h可使LDH释放量由45％减至32％（P＜0．01）。他克林预处理能延迟和减少星形孢菌素诱导的Bax表达的上调，同时增加了星形孢菌素诱导12－24h后Bcl-2的表达水平。结论：他克林预处理对星形孢菌素诱导的凋亡性损伤有显著保护作用，可能通过抑制或延迟Bax表达及促进Bcl-2表达来发挥神经保护作用。     

TDAG51基因在PC12细胞中的过表达及其致凋亡作用

目的　探讨TDAG5 1基因在PC12细胞中的表达及其作用机制。方法　实验分为3组,实验组用绿色荧光蛋白质粒(p EGFP - C1 )载体把外源性TDAG5 1基因转染的PC12细胞;空载体对照组用p EGFP- C1 转染的PC12细胞;对照组未转染任何试剂的PC12细胞。在转染后2 4 h、4 8h、72 h收集细胞,用Western blotting检测过表达的TDAG5 1蛋白;转染后84 h用相差显微镜观察PC12细胞形态的变化;Hoechst332 5 8染色观察细胞核形态变化;检测凋亡执行蛋白Caspase- 3的变化。结果　TDAG5 1基因在PC12细胞中高表达;TDAG5 1基因过表达的细胞与两对照组细胞相比较,胞体变圆,轴突缺失;荧光显微镜下观察PC12细胞可见胞核固缩、染色质凝集,并可见核碎片;前Caspase- 3蛋白活化被切割;活化的17k Da Caspase- 3随TDAG5 1蛋白的作用时间延长而增多。结论　过表达TDAG5 1基因可诱导PC12细胞凋亡。     

甘露醇与尼莫地平联合应用对大鼠创伤性脑水肿以及水通道蛋白-4表达的影响

目的观察甘露醇与尼莫地平联合应用对大鼠挫裂伤脑组织水通道蛋白-4（AQP-4）表达的影响。方法成年Wistar大鼠54只,随机分为挫裂伤组、甘露醇治疗组、甘露醇与尼莫地平联合治疗组。采用文献报告的方法制作大鼠左顶叶皮层局限性脑挫裂伤模型。各组分别于脑挫裂伤后24、48、72h取挫伤区脑组织,检测其含水量以及AQP-4的表达。结果随着伤后时间的增加;各组脑组织含水量增加,AQP-4mRNA和AQP-4蛋白的表达均逐渐增高（P〈0．0．5）;与挫裂伤组相比较,甘露醇治疗组伤后各时间点脑组织含水量、AQP-4mRNA和AQP-4蛋白的表达均明显增加（P〈0．05）;甘露醇与尼莫地平联合治疗组伤后各时间点与前两组相比,脑组织含水量及AQP-4mRNA和AQP-4蛋白的表达均明显降低（P〈0．05）。结论脑挫裂伤后,AQP-4mRNA和AQP-4蛋白的表达增加;脯组织含水增加,甘露醇联合应用尼莫地平后,能够下调AQP-4mRNA和AQP-4蛋白的表达,有效缓解创伤性脑水肿。     

双他克林对原代培养小鼠星形胶质细胞缺氧缺糖损伤的保护作用

目的 :研究一种新的乙酰胆碱酯酶抑制剂双他克林在缺氧、缺糖诱导的细胞坏死和细胞凋亡中的作用。方法 :用缺氧和缺糖来诱导原代培养的小鼠大脑皮层星形胶质细胞损伤 ,通过测定 L DH释放量观察细胞存活率 ;相差显微镜和 Hoechst 33342染色观察细胞和核形态 ,并计数核固缩的细胞数量。结果 :缺氧、缺糖 6 h后约 6 0～ 70 %的细胞发生凋亡 ,使用双他克林 (1- 10 n M)可有效抑制缺氧、缺糖诱导的细胞凋亡 ,从形态学和生化检测两方面均可证实这一结果。结论 :双他克要可保护星形胶质细胞免受缺氧、缺糖性损伤。提示除了 AD外 ,该药还可用于血管性痴呆的治疗     

银杏内酯B对H_2O_2诱导PC12细胞氧化损伤的影响

目的 :探讨银杏内酯B(ginkgolideB)对过氧化氢 (Hydrogenperoxide ,H2 O2 )引起PC12细胞氧化损伤的保护作用。方法 :用噻唑兰 (MTT)检测PC12细胞的存活率 ;乳酸脱氢酶法检测PC12细胞损伤 ;用硫代巴比妥酸法测定细胞脂质过氧化物 ;同时检测细胞内抗氧化酶的活性。结果 :PC12细胞在 5 0～ 30 0 μmol LH2 O2 作用 3h后 ,细胞的死亡率及乳酸脱氢酶 (LDH)释放明显增加 ,抗氧化酶如超氧化物歧化酶 (superoxidedismutase ,SOD)、谷胱甘肽过氧化酶 (glutathioneperoxidase ,GSH Px)活性显著降低 ,而脂质过氧化物生成增多。银杏内酯B 10～ 10 0 μmol L能显著降低细胞死亡率、LDH释放及丙二醛 (MDA)的生成 ,且能明显提高抗氧化酶的活性。结论 :银杏内酯B可拮抗H2 O2 引起的PC12细胞损伤 ,其机理可能与银杏内酯B减少脂质过氧化物的生成 ,提高抗氧化酶的活性有关