泛素连接酶Cbl-b在黑素瘤组织和细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义

目的：探讨泛素连接酶Cbl?b在皮肤黑素瘤组织及黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义。方法收集69份黑素瘤、30份色素痣组织,采用免疫组化法检测Cbl?b蛋白表达水平。实时荧光定量PCR、免疫印迹法分别检测黑素瘤细胞系A375、M14、MV3及黑素细胞中Cbl?b mRNA及蛋白表达水平。结果69份皮肤黑素瘤标本中,52份（75.36%）表达Cbl?b;30份色素痣标本中,4份（13.33%）表达Cbl?b,两组Cbl?b蛋白表达水平差异有统计学意义（χ2=32.745,P<0.01）。黑素瘤组织中Cbl?b表达水平与肿瘤进展程度、Clark分级和Breslow厚度均呈正相关（rs分别为0.569、0.654、0.727,均P<0.01）。实时荧光定量PCR显示,A375、M14、MV3细胞Cbl?b mRNA表达差异有统计学意义（F=176.537,P<0.01）。免疫印迹法显示,A375细胞Cbl?b蛋白表达水平最高,黑素细胞最低。结论 Cbl?b蛋白在皮肤黑素瘤组织及其细胞株中均高表达。     

不同剂量疏血通注射液治疗不稳定型心绞痛的有效性和安全性分析

目的:分析不同剂量疏血通注射液治疗不稳定型心绞痛的有效性和安全性.方法:采用抽签法将安阳市中医院心病一科2014年3月~2015年4月113例不稳定型心绞痛患者进行分组,对照组56例给予疏血通注射液6mL/d治疗,观察组57例给予疏血通注射液10mL/d治疗,观察两组临床疗效及不良反应.结果:观察组治疗后总有效率91.23%高于对照组的76.79%,P<0.05;观察组不良反应发生率1.75%低于对照组的1.79%,P>0.05.结论:在西医常规治疗的基础上,应用10mL剂量的疏血通注射液通过抑制血小板聚集,溶解新形成的血栓,改善心肌缺血治疗不稳定型心绞痛效果确切,安全性高,值得临床推广.     

前列腺特异的转录因子NKX3.1上调 Dicer1 基因的表达

目的: 研究前列腺特异转录因子NKX3.1对 Dicer1 基因表达的影响。方法: 转染pcDNA3.1-NKX3.1至前列腺癌PC3细胞,通过G418筛选,有限稀释法克隆培养获得NKX3.1稳定转染的PC3细胞-PC3(+);采用基因芯片检测NKX3.1对前列腺癌PC3细胞基因组表达谱的影响。进一步应用RT-PCR、Western blotting进行验证。为进一步检测 Dicer1 表达增高、促进microRNA的成熟作用,构建了microRNA let-7a-1靶序列-报道基因融合质粒,转染PC3细胞和PC3(+)细胞,通过报道基因检测成熟microRNA let-7a-1对其靶序列的作用。结果: 基因组芯片显示,NKX3.1稳定表达的PC3(+)细胞中, Dicer1 表达明显高于PC3细胞。RT-PCR、Western blotting结果验证PC3(+)细胞中Dicer1 mRNA和蛋白质的表达水平均高于PC3细胞。microRNA let-7a-1靶序列-报道基因融合质粒,转染PC3细胞和PC3(+)细胞后,报告基因检测,PC3(+)细胞中荧光素酶活性明显低于PC3细胞。结论: NKX3.1可上调前列腺癌PC3细胞中Dicer1的表达,促进microRNA的成熟及作用。     

PKCI-1/HINT1表达质粒的构建及其对黑素瘤A375细胞凋亡及自噬影响的初步研究

目的 构建人PKCI-1/HINT1基因的真核表达质粒,研究其在人黑素瘤A375细胞株中的表达并检测其对A375细胞凋亡及自噬的影响.方法 以人黑素瘤细胞A375的总RNA为模板,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增PKCI-1/HINT1基因序列,将PKCI-1/HINT1基因克隆到真核表达载体PCDNA3.1(+)中,构建PCDNA3.1(+)-PKCI-1/HINT1重组体.将PCDNA3.1(+)-PKCI-1/HINT1表达载体瞬时转染黑素瘤A375细胞,RT-PCR及Western印迹检测PKCI-1/HINT1在细胞内的表达,并以PCDNA3.1(+)空载体转染细胞作为相应对照组.噻唑蓝(MTT)检测PKCI-1/HINT1转染后细胞的增殖变化,Hoechest 33258染色检测细胞凋亡,采用绿色荧光蛋白-微管相关蛋白轻链3(GFP-LC3)标记结合激光共聚焦显微镜法检测PKCI-1/HINT1对细胞自噬的的影响,并通过Western印迹检测PKCI-1/HINT1对细胞内caspase 3及自噬相关蛋白beclin1蛋白表达的影响.结果 PCDNA3.1 (+)-PKCI-1/HINT1真核表达载体经酶切及测序鉴定构建成功,并能够在细胞内有效表达.MTT检测发现PKCI-1/HINT1能够明显抑制A375细胞的增殖,与PCDNA3.1(+)对照组相比,在48 h,72 h及96 hPCDNA3.1 (+)-PKCI-1/HINT1组活细胞数分别减少17.0％,25.6％、29.4％,差异有统计学意义(均P＜0.05).Hoechest 33258染色显示PKCI-1/HINT1可促进A375细胞内凋亡小体形成.激光共聚焦显微镜发现PKCI-1/HINT1的过表达可使A375细胞内GFP-LC3B的点状聚集增加.Western印迹发现,PKCI-1/HINT1可促进细胞内caspase 3及beclin1蛋白表达.结论 成功构建真核表达载体PCDNA3.1 (+)-PKCI-1/HINT1并在细胞内有效表达PKCI-1/HINT1.PKCI-1/HINT1的高表达可以抑制A375细胞增殖,促进其凋亡,同时可引发A375细胞的自噬过程.     

shRNA介导黑素瘤A375细胞Cbl-b基因沉默前后蛋白质组学分析

目的 分析shRNA介导黑素瘤A375细胞 Cbl?b基因沉默前后差异表达蛋白。方法 使用非标记定量蛋白质组学技术鉴定分别用Cbl?b shRNA慢病毒载体（Cbl?b shRNA组）和对照慢病毒载体（对照组）转染的A375细胞的差异表达蛋白。采用生物信息学方法对筛选的差异蛋白进行基因本体富集及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。Western 印迹验证差异蛋白（EphA2、GSK3β）表达和Cbl?b shRNA沉默后两组p?AKT表达。采用SPSS 23.0软件进行统计分析,两组间蛋白丰度比较采用两样本t检验。基因本体及KEGG富集分析结果采用Fisher精确概率法检验。结果 共鉴定3 449种蛋白,筛选出Cbl?b shRNA组和对照组差异表达蛋白74个。与对照组相比,Cbl?b shRNA组52个蛋白表达上调,22个下调。差异蛋白基因本体富集分析发现前5位显著富集生物学过程为整合素介导细胞黏附、单一生物代谢过程、整合素介导细胞黏附调节、蛋白质靶向线粒体调节、核酸代谢过程;前5位显著富集分子功能为DNA结合、2,2铁硫簇合物结合、信号受体活性、钙黏蛋白结合、细胞黏附分子结合;前5位显著富集的细胞组分为核小体、DNA包装复合体、光感器连接纤维、DNA-蛋白质复合体、胞外区部分。京都基因与基因组百科全书通路富集分析发现,前5位与黑素瘤相关的显著富集通路包括叶酸生物合成、轴突导向、细胞外基质受体相互作用、黏合连接、Wnt 信号通路。Western 印迹检测显示,Cbl?b shRNA组EphA2相对表达水平降低（0.369,以对照组表达水平为1计算）,GSK3β表达增加（3.524）,该结果与蛋白质组学检测结果一致;p?AKT相对表达水平降低（0.453）。结论 Cbl?b可能通过多种生物学通路参与黑素瘤发病;EphA2/PI3K/AKT信号通路可能是Cbl?b参与黑素瘤形成的重要机制之一。     

某医院体检人群糖尿病预测模型研究

目的 探讨logistic回归和随机森林在体检人群糖尿病患病风险预测中的应用。 方法 选择2006年1月-2015年12月在北京航天总医院体检中心参加体检的非糖尿病者11 769例次,随机选取70%样本,以性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史、高血压既往史、高血压家族史、糖尿病家族史、收缩压、舒张压、空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、脂肪肝等14个因素作为自变量,以5年内是否罹患糖尿病作为因变量,基于logistic回归和随机森林分别建立糖尿病预测模型。将预测模型应用于剩余30%样本,根据所得受试者工作特征曲线的曲线下面积(AUC)评价模型的预测效果。 结果 Logistic回归预测模型和随机森林预测模型的AUC分别为0.912(95%CI:0.898~0.927)和0.919(95%CI:0.906~0.932),在最佳临界点,Logistic回归预测模型的灵敏度和特异度分别为80.8%和87.3%,随机森林预测模型的灵敏度和特异度分别为84.1%和85.3%。 结论 Logistic回归预测模型和随机森林预测模型对体检人群的糖尿病患病风险均具有良好的预测能力。     

miR Let-7a1/f1下调前列腺癌1LNCaP细胞中AMD1蛋白的表达

目的研究let-7a1/f1在前列腺癌LNCaP细胞中对S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(AMD1)表达的影响及作用机制。方法以LNCaP细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增let-7a1/f1基因的前体序列,将其克隆到pSilencerTM4.1-CMV neo载体中,构建成let-7a1/f1真核表达载体pSilencer-let7a1/f1。瞬时转染LNCaP细胞后,通过RT-PCR法,检测let-7a1/f1在转录水平的表达,同时通过RT-PCR及Western blot检测AMD1在转录和翻译水平的表达变化。构建AMD1基因3’非翻译区(3’-UTR)荧光素酶报告基因融合质粒(pMIR-AMD1),并与pSilencer-let7a1/f1共转染LNCaP细胞,通过双荧光素酶活性检测,确定let-7a1/f1对AMD1 3’-UTR的作用。结果 pSilencer-let7a1/f1和pMIR-AMD1经酶切电泳及测序鉴定正确,pSilencer-let7a1/f1转染LNCaP细胞后,let-7a1/f1表达明显上升,AMD1在转录水平无变化,在翻译水平明显下降,let-7a1/f1转染后,pMIR-AMD1的荧光素酶活性明显降低。结论 miR Let-7a1/f1可作用于AMD1 3’-UTR靶点,抑制AMD1蛋白的翻译,从而降低LNCap细胞中AMD1蛋白的水平。     

组氨酸三聚体核苷结合蛋白1在黑素瘤组织中的表达及其基因启动子甲基化水平研究

目的：检测组氨酸三聚体核苷结合蛋白1（HINT1）在黑素瘤中的表达和HINT1基因启动子甲基化状态,探讨HINT1启动子甲基化与临床病理参数的关系。方法采用甲基化特异性PCR（MSP）法检测56例黑素瘤及瘤旁组织和51例色素痣组织中HINT1基因启动子区甲基化水平,免疫组化法检测56例黑素瘤和51例色素痣组织中HINT1蛋白的表达。结果 MSP显示,黑素瘤组织、瘤旁组织及色素痣组织中HINT1基因启动子区甲基化率分别为76.8%（43/56）、33.9%（19/56）和35.3%（18/51）,黑素瘤组HINT1基因启动子区甲基化率明显高于瘤旁组织组和色素痣组,且差异有统计学意义（χ2=20.810、18.749,均P<0.05）,瘤旁组织组与色素痣组间差异无统计学意义（χ2=0.022,P>0.05）。免疫组化显示,56例黑素瘤和51例色素痣组织中分别有12例（21.4%）和42例（82.4%）HINT1蛋白阳性表达,两组阳性率差异有统计学意义（χ2=39.633,P<0.01）。12例HINT1蛋白阳性的黑素瘤组织中,有6例HINT1基因启动子甲基化,而在44例HINT1蛋白阴性的癌组织中HINT1启动子甲基化率高达84.1%（37/44）,两组差异有统计学意义（χ2=6.147,P=0.013）。56例黑素瘤中,HINT1基因启动子区甲基化率在Clark分级Ⅰ~Ⅱ级组（59.1%,13/22）与Ⅲ~Ⅴ级组（88.2%,30/34）间差异有统计学意义（χ2=6.365,P=0.012）。结论 HINT1在黑素瘤组织中低表达,其机制可能与启动子区发生高甲基化有关;HINT1启动子区高甲基化可能参与黑素瘤的发生及发展。     

Cbl-b基因shRNA干扰载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠Cbl-b基因RNA干扰（RNAi）的真核表达质粒,并初步鉴定其干扰效果,为后续研究Cbl-b在黑素瘤免疫治疗中的作用奠定基础。 方法 根据基因库提供的Cbl-b cDNA序列,设计并合成4对短发夹结构的互补DNA序列,克隆至载体PGPU6/GFP/Neo构建重组质粒,并予以DNA测序鉴定。重组干扰质粒构建成功后,将干扰质粒与Cbl-b过表达载体共转染293T细胞,于转染后48 h,通过实时荧光定量PCR法及蛋白质印迹法检测各质粒对Cbl-b基因的表达抑制效应。 结果 测序分析证实,4对shRNA寡核苷酸序列分别成功插入至shRNA真核表达载体PGPU6/GFP/Neo中,将构建成功的PGPU6/GFP/Neo-shRNA质粒与Cbl-b真核表达载体共转染细胞48 h后,通过荧光实时定量PCR法及Western 印迹测定,发现4条shRNA序列对Cbl-b的表达均有一定的抑制效应,其中以1号shRNA序列重组质粒对Cbl-b表达的抑制程度最高（P ＜ 0.05）。 结论 成功构建并筛选出沉默效应最高的Cbl-b shRNA真核细胞表达载体。