云南恶性疟病例疟原虫Pfhrp2基因序列多态性分析董莹1|孙艾明1|2|陈梦妮1|徐艳春1|毛祥华1|邓艳1|杨恒林1*

目的 目的 分析云南省恶性疟病例疟原虫虫株的富组氨酸蛋白Ⅱ （Histidine?rich protein?2,HRPⅡ） 基因 （Pfhrp2） 序 列的多态性, 为研究疟原虫抗原基因缺失奠定基础。方法 方法 搜集2012年8月-2015年9月云南省恶性疟现症病例的滤纸 血样和相关信息, 用PCR技术扩增血样中恶性疟原虫Pfhrp2基因exon2区并测序, 测序成功序列与AY816237、 AY816240、 AY816301参比序列比对; 用Mega 5.04分析Pfhrp2基因exon2区序列多态性, 计算序列间保守位点、 遗传距离 等; 根据氨基酸序列间遗传距离绘制聚类树状图。结果 结果 共收集云南省15个州 （市） 的恶性疟现症病例血样218份, 病例 感染来源地包括云南本地、 非洲、 缅甸等流行区。其中155份Pfhrp2基因exon2区扩增阳性和测序成功, 编码氨基酸数在 115～298之间, 平均为239.7 aa, 非洲 （239.9 aa）、 缅甸 （239.5 aa）、 云南 （241.6 aa） 感染虫株的氨基酸残基均数差异无统计 学意义 （F = 0.025, P > 0.05）。所有氨基酸残基序列均以12型重复作为结尾, 以1型、 2型重复为起始, 比例各占98.1% （152/155） 和1.9% （3/155）, 2型重复次数最多, 为12.9次。155条Pfhrp2 基因exon2区DNA序列的同源位点为894 bp, 保 守位点占20.8% （186/894）, 变异位点占78.2% （699/894）, 非洲虫株序列间遗传距离为0.000～0.741, 缅甸为0.000～ 0.948, 云南为0.000～0.750。所有155条序列按氨基酸序列大小聚类成3个大类, 同一个层级的序列具有近似的序列长 度和氨基酸重复类型。结论 结论 云南省恶性疟现症病例所感染疟原虫的Pfhrp2基因exon2区存在高度多态性, 恶性疟原虫 株主要按Pfhrp2基因exon2区的氨基酸序列长度进行聚类。     

云南省间日疟患者G6PD基因编码区的突变分析

目的分析云南省间日疟患者的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因编码区突变多态及其与伯氨喹性溶血现象易发的规律。方法收集云南省2018年经"氯喹/伯氨喹八日疗法"治疗的间日疟病例血样。以服用伯氨喹期间患者出现"茶色"尿液体征、G6PD酶活性下降判断为伯氨喹诱发急性溶血。提取血样的人基因组DNA,PCR分别扩增含G6PD基因的12个外显子片段并测序。与G6PD基因非突变型序列比对,用DNAStar11.0、BioEdit 7.2.5等软件整理、拼接测序序列获得G6PD基因的cDNA序列。用MEGA 5.04、DnaSP 5.10软件分析cDNA序列的突变多态、选择效应等。计算突变多态与伯氨喹诱发性溶血发生的相关性系数(r)和比值比(OR)。结果共收集间日疟患者血样184份,获得44份血样的G6PD基因完整cDNA链(长度为1545 bp),其中1条来自溶血病例的基因组。44条c DNA链与非突变型序列比对的突变位点包括c.461 T>A、c.574 C>T、c.786 C>T、c.1059 C>T、c.1311 T>C和c.1376 G>T,频率分别为1.5/10万、1.5/10万、1.5/10万、1.5/10万、45.6/10万和1.5/10万。c.1311和c.1376的双位点突变连锁仅存在于溶血病例的基因组,且c.1376位点突变与伯氨喹性溶血的发生为正相关关系(r=1.000,P>0.05)。44条cDNA链定义为6种单倍型(Hap1~Hap6),单倍型期望杂合度(He)、核酸多样性指数(π)、Ka/Ks比值分别为0.493、0.001和0.062;c.1311单点突变的Hap2占比最多,为68.2%(30/44),高频率突变位点c.1311的等位组成亦最复杂,出现非突变半合(9/44,20.4%)、突变半合(16/44,36.4%)、非突变纯合(5/44,11.5%)、突变杂合(10/44,22.7%)、突变纯合(4/44,9.1%)等5种合子。c.1311位点突变与伯氨喹性溶血发生的OR值为0.6879(P>0.05),未显示关联性。Tjima’s中性检验D值为-1.414(P>0.05),且全段的D值均<1,表明研究序列检出的突变不属于定向选择压力下的非中性突变,Ka/Ks比值为0.062,说明研究序列非常保守、错义突变率低于同义突变率。结论云南省间日疟患者中,常见的G6PD基因编码区突变为c.1311位点的T>C碱基替换,但仅c.1376位点的G>T突变与氧化剂突变诱发性溶血的发生呈正相关性。     

云南省疟疾病例地理聚集特征分析

目的了解云南省疟疾病例的地理分布特征,为疟疾消除工作提供借鉴。方法收集2012-2015年云南省疟疾病例资料,建立数据库并分析病例聚集情况。结果 2012-2015年云南省共计报告疟疾病例2 586例,其中本地感染274例,占10.60%,境外输入2 311例,占89.37%,外省输入1例,占0.03%;按照来源地与病例所在地分别统计境外输入病例数与本地病例数,算术均数分别为96.29和10.96,标准差分别为421.18和19.12,均数差异无统计学意义(Z=-0.326,P0.10)。境外输入区域与本地感染区域的聚集性均可以群集数5来初分,均具备地理聚集的特点。境外输入病例与本地病例的赫尔芬达尔-赫希曼指数分别为8 121和1 598。结论云南省境外感染病例与本地感染病例分布差异不显著,防治工作需要并重进行;境外输入病例的不均匀度比本地感染病例高,但在防治上均可以划分为5个重点集群。     

云南省输入性疟疾病例时间分布特征分析

目的研究云南省输入性疟疾病例的时间分布特征,掌握输入性疟疾的流行动态。方法收集疟疾个案调查表和流行病学资料,剔除本地感染病例,整理归纳并进行统计分析。结果云南省输入性疟疾病例具有季节周期性(Q=26.574,P0.05)和趋势性(Q=35.487,P0.05),输入高峰为5月,低谷为2月,输入病例数差异有统计学意义(Z=-2.619,P0.05)。简单季节性模型为最佳分析预测模型(R~2=0.677,BIC=4.867),残差序列为白噪声(Q=14.226,P0.05)。运用模型对2016年1月、2月、3月的输入性疟疾病例数进行预测,预测值(95%CI)分别为29(7~50)、22(0~44)和31(8~54),实际发病数为29、24和38例,均在预测值的95%CI内。结论云南省输入性疟疾病例具有季节性和趋势性特征,所构建模型对近期病例有较好的预测效果。     

2012-2014年云南省疟疾实验室诊断质量分析

目的分析云南省的省、县两级实验室疟疾镜检诊断质量及影响因素。方法 2012年8月-2014年10月,云南省各疫情报送单位采集镜检确诊为疟疾的患者血样,制作血涂片和滤纸血送至省级疟疾参比实验室进行镜检和基因检测,并统计分析省、县两级实验室疟疾诊断的符合性。结果 2012年8月-2014年10月云南省的72个县镜检确诊疟疾病例1 400例,其中恶性疟、间日疟和未分型疟疾分别占18.4%(252/1 400)、79.3%(1 105/1 400)和3.1%(43/1 400),未分型疟疾比例最高为2012年的3.5%(9/257)。2012年云南各县与省级疟疾参比实验室疟原虫镜检结果的虫种符合率为70.1%(845/1 216),为2012-2014年期间的最低水平,血片疟原虫阳性符合率为77.6%(943/1 216)。各县的疟原虫镜检结果与省级实验室基因检测的虫种符合率、阳性符合率也是2012年最低,分别为81.3%(150/185)和85.0%(157/185)。省级实验室镜检与基因检测结果的不符合率为8.7%(97/1 120),不符合类型中以镜检阴性而基因检测为恶性疟原虫、间日疟原虫或恶性疟/间日疟原虫混合感染为主,占57.7%(56/97)。各县采集疟疾病例血样的覆盖率最低为2012月11月的46.9%(82/175)。2012-2014年全省血涂片制作质量得分分别为69.8、70.4和78.8(P0.05)。结论 2013年后除个别县外,云南省的县级疟疾实验室诊断各环节的工作质量均显著提高。     

不同感染来源恶性疟原虫裂殖子表面蛋白3基因多态性分析及抗原表位预测

目的分析云南省不同感染来源恶性疟原虫裂殖子表面蛋白3(PfMSP-3)基因和抗原表位多态性。方法收集2012年8月-2016年12月寄生虫病防治信息管理系统登记报告的云南省本地和输入恶性疟病例的血样和流行病学史等信息。提取血样的疟原虫DNA,半巢式PCR扩增PfMSP-3基因并测序,与Gen Bank中的恶性疟原虫Pf3D7、PfK1分离株的参比序列LN999944.1、U08851.1进行比对。用MEGA 5.04、Arlequin 3.5.2.2分析PfMSP-3基因的单倍型、期望杂合度(He)、群体间遗传分化指数(Fst)。用Network 4.6.0构建单倍型网络进化图。用Dna SP 5.10计算核苷酸的非同义(Ka)、同义置换率(Ks)。用IEDB在线预测软件预测PfMSP-3肽链T细胞、B细胞抗原表位。结果共收集190份恶性疟病例血样,其中181份扩增出长1 100 bp的PfMSP-3片段,测序成功167份(缅甸121份、非洲37份、云南本地感染9份)。序列比对结果显示,167条DNA序列存在36种单倍型,He为0.409±0.183,Ka/Ks为0.98。各单倍型沿Pf3D7型(Ⅰ)、过渡型(Ⅱ)及PfK1型(Ⅲ)等3种方向进化:H_1、H_9等7种单倍型为Pf3D7型,H_7、H_8等6种单倍型为过渡型,H_2、H_3等23种单倍型为PfK1型。Pf3D7型、过渡型和PfK1型序列的占比分别为49.7%(83/167)、12.6%(21/167)和37.7%(63/167)。PfMSP-3基因在非洲与缅甸恶性疟原虫群体间的分化程度最高,Fst=0.049;在非洲与云南本地感染恶性疟原虫群体间最小,Fst=0.032。抗原表位分析结果显示,36种单倍型的PfMSP-3肽链亲水性高于疏水性,指数分别为1.050~2.535和-2.583~-3.544。T细胞抗原表位活性为-1.1;B细胞抗原表位活性平均0.5,且表现为Pf3D7型过渡型PfK1型。结论云南省不同感染来源恶性疟原虫的PfMSP-3基因存在3类基因型,不同基因型PfMSP-3蛋白B细胞抗原表位活性的预测值较T细胞高。     

云南省重点地区疟疾病例G6PD基因突变研究

目的 通过分析云南省间日疟病例G6PD基因特征,摸清病例G6PD基因分子流行病学分布,为云南省疟疾规范治疗提供技术参考。方法 收集2016年度云南省间日疟病例标本和病例流行病学史等信息,对照G6PD基因特征序列,采用聚合酶链式反应扩增目的基因片段,获得分析片段,对获取的片段进行电泳并进行序列测定。结果 使用MEGA及SPSS进行分析,分析位点突变率、群体间遗传分化指数及地区间突变差异情况。结果共计检测样本188份,基因主要突变类型为点突变（point mutation）,20280 C>T和1311 T>C突变率较高,突变率均为78.1%（147/188）,1311 T>C系沉默突变（silent mutation）,20280 C>T突变表现为单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism）;未发现A95G、G1376T和G1388A突变。通过比对,云南间日疟病例G6PD基因与GenBank G6PD基因遗传距离为0.00~0.028,1311突变型（T>C）与1311野生型遗传距离为0.021。腾冲市1311 T>C突变率为92%（23/25）,盈江县1311 T>C突变率为77.8%（102/131）,两者差异无统计学意义（P>0.05）。结论 云南省间日疟病例G6PD基因主要突变位点地区间差异不明显,现有的疟疾治疗方案不需要调整,但治疗时应密切关注药物性溶血的发生。     

云南省不同感染来源间日疟原虫环子孢子蛋白基因多态和种群结构分析

目的分析云南省不同感染来源间日疟原虫环子孢子蛋白(Pvcsp)基因序列,揭示当地Pvcsp基因的种群结构和遗传多样性。方法收集中国疾病预防控制中心传染病网络直报系统中2014-2017年报告的云南省本地和输入性间日疟病例流行病学资料及血样。提取血样中疟原虫基因组DNA,巢式PCR扩增并测序。采用MEGA 5.04、Arlequin 3.5.2.2软件进行单倍型、期望杂合度(He)分析,DnaSP 5.10计算核苷酸多样性(TT)、同义置换率(Ks)、错义置换率(Ka)及群体间遗传分化指数(Fst)。结果共检测间日疟病例血样969份,扩增获得650~750 bp大小的目的条带759份,包括云南本地感染者血样39份、非洲16份、缅甸688份、老挝13份、柬埔寨2份、巴基斯坦1份。单倍型分析结果显示,759条Pvcsp基因序列存在90个单倍型,其中29个为PV-I型温带族(类似VK210型),50个为PV-Ⅰ型热带族(类似VK210型),11个为PV-Ⅱ型(类似VK247型);3种基因型所占比例分别为51.4%(390/759)、41.1%(312/759)、7.5%(57/759),分布于云南本地感染、缅甸输入性病例中,但非洲、老挝及其他地区的输入性病例只表现为PV-Ⅰ型。PV-Ⅰ型、PV-Ⅱ型氨基酸序列突变分别发生在29、10个位点。759份病例血样的He为0.224,π为0.075,Ka/Ks为0.48。除去柬埔寨和巴基斯坦,Pvcsp基因在老挝输入性病例中的遗传多样性最高(He=0.422,π=0.03),云南本地与非洲输入性病例中的遗传分化最高(Fst=0.082),与缅甸输入性病例的遗传分化最低(Fst=0.002);Pvcsp基因在非洲与东南亚地区输入病例中属中等程度的遗传分化,在东南亚地区输入病例中遗传分化很小。结论云南省不同感染来源间日疟原虫环子孢子蛋白基因存在3种基因型,以PV-Ⅰ型温带族为优势虫株,不同基因型的种群结构和遗传分化不同。     

不同感染来源间日疟原虫抗叶酸类药物相关基因的研究

目的分析云南省不同感染来源间日疟原虫抗叶酸类药物抗性相关基因二氢叶酸还原酶基因(Pvdhfr)和二氢叶酸合成酶基因(Pvdhps)的突变特点。方法收集2012年8月-2016年12月寄生虫病防治信息管理系统登记报告的云南省间日疟病例血样和流行病学史等信息。提取疟原虫DNA,巢式PCR扩增Pvdhfr和Pvdhps基因并测序,测序序列与Gen Bank中的间日疟原虫Pvdhfr(登录号为X98123)、Pvdhps基因(登录号为PVX_123230)参比序列比对。用MEGA 5.04、Arlequin 3.5.1分析Pvdhfr和Pvdhps基因的单倍型、期望杂合度(He)、遗传分化指数(Fst)等。用Network 4.6.0、Arc Gis10.1构建单倍型网络进化图和突变型分布图。结果 共收集1 203份疟疾病例血样,缅甸、非洲、云南本地感染病例血样分别为1 060、79和64份。Pvdhfr、Pvdhps基因PCR扩增产物分别测序成功272份和708份。分析结果显示,Pvdhfr基因的272条序列存在53种单倍型,He为0.243,其中云南本地分离株群体的He最高,为0.667;12个位点均为野生型的频率是8.1%(22/272),其余52种单倍型在12个位点上存在单点或双重、三重、四重、五重、六重错义突变的不同突变型。Pvdhps基因的708条序列存在35种单倍型,He为0.153,其中缅甸感染分离株群体的He最高,为0.142;5个位点均为野生型的频率是36.2%(256/708),其余34种单倍型在5个位点形成29种错义突变,产生单点、双重、三重、四重等多种突变型。Pvdhfr及Pvdhps基因均以野生型为起始,再按单重突变到多重突变的路径逐步进化。Pvdhfr基因的野生型和突变型血样中,Pvdhps基因突变型的比例分别为18.2%(4/22)和65.6%(147/224)。Pvdhps、Pvdhfr基因突变型的血样分别分布在14和9个州(市),且以缅甸感染血样占多数,分别占97.3%(440/452)和95.4%(144/151)。结论云南省不同感染来源间日疟原虫抗叶酸类药物抗性相关基因Pvdhfr、Pvdhps的突变率、突变程度均高。     

不同感染来源疟原虫虫株的18S sRNA基因同源性分析

目的分析云南省不同感染来源疟原虫株的遗传差异。方法采集不同地区疟疾患者的血样,利用巢式PCR扩增疟原虫18SsRNA基因,扩增产物进行双向测序分析,以分子进化树描述18SsRNA基因序列的同源程度。结果对2012年8月~2013年8月期间诊断为云南当地感染的全部疟疾患者22例及感染地为缅甸、非洲、老挝的13例疟疾患者血样进行18SsRNA基因巢式PCR扩增,8份检出恶性疟原虫目的基因片段(205bp)、35份检出间日疟原虫目标片段(120bp)。对43份PCR扩增阳性产物进行测序分析,其中8株恶性疟原虫的18SsRNA基因进化树显示属云南本地感染的虫株与非洲虫株分布在不同亚支,但均与鸡疟原虫(Plasmodium gallinaceum)(Accession:M61723)遗传进化关系较近;35株间日疟原虫的18SsRNA基因进化树显示所有虫株均集中在一个进化分支内,与食蟹猴疟原虫(P.cynomolgi)(Accession:L07559)遗传关系较近,89%的云南本地感染虫株与南美两个虫株(Accession:X13926、U03079)同在一个进化亚支。结论恶性疟原虫不同地理株的18SsRNA基因序列差异性较间日疟原虫株间的差异性更明显。