小分子乙型肝炎病毒基因组缺失突变体结构分析

目的 了解小分子HBV基因组缺失突变体的基因结构及特点.方法 采用一步法PCR从慢性乙型肝炎患者血清中扩增全基因组HBV DNA,回收并克隆＜1 kh的小分子HBV DNA,测序并以BioEdit及VectorNTI 6.0软件分析基因结构特点.结果 获得基因长度介于174～986 bp之间的64种、共124个小分子HBV缺失突变体DNA,按基因结构特点分为3类,即3种GT-AG剪接变异体、29种"常规"缺失突变体及32种基因组内部含polyA的缺失突变体.所有小分子基因组缺失突变体在HBV各编码区及基因调控区均存在不同程度缺失,其中66%(42/64种)保留与HBV复制(包装)相关的所有顺式调控序列,48%(31/64种)保留X编码区.结论 乙型肝炎患者血清中普遍存在小分子HBV基因组缺失突变体,深入了解这些变异体的结构和功能,有助于进一步探索HBV的致病机制.     

乙型肝炎病毒X蛋白基因型特异性功能差异

目的研究B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）功能差异。方法B、C基因型乙型肝炎病毒X基因真核表达载体（分别为pcDNA3．1－XB及pcDNA3．1－XC）及空白载体pcDNA3．1／Hygro（－）以脂质体2000分别转染Chang细胞，转染细胞2d后以流式细胞仪检测凋亡率；转染细胞以潮霉素筛选，14d后形成的抗性细胞集落以冷甲醇固定、Gimsa染色并计数；各载体与指示载体pCMVβ共转染细胞，转染2d后裂解细胞并检测胞内β-半乳糖苷酶的活性。所有数据均以配对t检验进行分析。结果各载体转染Chang细胞后细胞的凋亡率为pcDNA3．1-XC〉pcDNA3．1-XB〉pcDNA3．1／Hygro（-），形成的抗潮霉素细胞集落数为pcDNA3．1／Hygro（-）〉pcDNA3．1-XB〉pcDNA3．1-XC，细胞内β-半乳糖苷酶活性为pcDNA3．1-XB＋pCMVβ〉pcDNA3．1-XC＋pCMVβ〉pcDNA3．1／Hygro（-）＋pCMVβ。结论B基因型HBx反式激活能力高于C基因型HBx，而抗细胞增殖及致细胞凋亡能力都低于C基因型HBx，HBx这些功能差异可能与R、C基因型乙型肝炎病毒致病性差异有关。     

酵母双杂交筛选与单剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的 筛选与单剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白.方法 PCR扩增单剪接型2.2 kb HBV剪接特异性新基因TPss并克隆于诱饵载体pGBKT7,在证实TPss蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛查与TPss蛋白相互作用的肝细胞蛋白,进而通过哺乳动物细胞双杂交实验验证候选肝细胞蛋白与TPss蛋白在Huh7和HepG2肝细胞中的相互作用.结果 构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-TPss,Western blot显示其在酵母中表达TPss蛋白.酵母双杂交筛选及哺乳动物细胞双杂交证实TPss蛋白可与4种肝细胞蛋白相互作用,即组织蛋白酶B、微粒体环氧化物水解酶、组织蛋白酶D与纤维蛋白原γ链.结论 TPss可与多种肝细胞蛋白相互作用.     

提高留学生医学微生物学教学质量初探

针对医学微生物学知识点繁杂琐碎、难于记忆和融会贯通的特点以及留学生教学过程中受到语言障碍、思维模式、文化差异等影响,提出克服语言障碍影响,提高课堂教学效果; 多渠道促进师生互动,加强沟通,激发学生对微生物学的学习兴趣; 引入PBL教学方法,增进学生对知识点的理解与应用; 充分利用实验教学,提高学生综合素质等措施提高教学质量。     

蛋白质磷酸酶4催化亚基调控乙型肝炎病毒X蛋白水平及生物学功能

目的探讨蛋白质磷酸酶4催化亚基(protein phosphatase 4 catalytic subunit, PP4C)对乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein, HBx)在蛋白质水平的调控及生物学功能的影响, 为乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)相关性肝癌提供潜在治疗靶点。方法通过免疫共沉淀(co-immunopreciptation, Co-IP)与GST pull-down试验验证HBx与PP4C在体内与体外的相互作用。采用Lipofectamine 3000试剂转染PP4C过表达真核质粒检测PP4C对HBx在蛋白质水平的影响, 并用蛋白质合成抑制剂环己酮亚胺(cycloheximide, CHX)处理过表达PP4C的肝癌细胞, Western blot检测HBx半衰期变化。磷酸化试验检测PP4C对HBx磷酸化水平的影响。CCK8增殖、细胞划痕、Matrigel侵袭小室试验检测PP4C对HBx生物学功能的影响。结果 Co-IP与GST pull-down试验证实HBx与PP4C在肝癌细胞内存在相互作用, 在体外也存...     

乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对病毒自身调控序列的影响

目的 研究双剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体特异性蛋白TPds对病毒自身调控序列的影响.方法 PCR扩增6种HBV启动子/增强子序列,以Kpn Ⅰ及Xho Ⅰ位点克隆于pGL3-basic,分别构建萤火虫荧光素酶重组报告载体pGL3-BCP(含HBV基本核心启动子)、pGL3-CP1601(含增强子Ⅱ的核心启动子)、pGL3-XP(X基因最小启动子)、pGL3-XP1071(含增强子Ⅰ的X基因启动子)、pGL3-SP1(表面抗原大蛋白基因启动子)、pGL3-SP2(表面抗原中蛋白基因启动子).以FuGENE6将TPds表达载体pcDNA3.1/HisC-TPds或空白载体pcDNA3.1/HisC分别与6种HBV启动子/增强子报告载体共转染Huh7细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性,实验重复5次,数据以SPSS11.5软件分析.结果 在一定的质量比值范围内,与pcDNA3.1/HisC空白载体对照相比,pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-CP1601、pGL3-XP1071、pGL3-SP1、pGL3-SP2共转染后,Huh7细胞内萤火虫荧光素酶活性增高,而pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-BCP或pGL3-XP共转染后,胞内荧光素酶活性无变化.结论 TPds蛋白可反式激活HBV启动子SP1、SP2和增强子Ⅰ、Ⅱ,对基本核心启动子和X基因最小启动子无影响.     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP257抗α-干扰素机制初步探讨

目的筛选与乙型肝炎病毒DNA聚合酶N端257个氨基酸（TP257）相结合的抗α-干扰素（IFN-α）相关性肝细胞蛋白,初步探讨TP257抗IFN—α作用机制。方法构建TP257腺病毒穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-TP257,并与腺病毒骨架载体pADEasy-1重组,以293A细胞包装重组腺病毒。用重组腺病毒感染Huh7细胞并以IFN-α诱导,收获细胞蛋白,Western blot验证TP257蛋白在细胞中的表达。细胞蛋白进行免疫沉淀,SDS-PAGE分离后通过质谱鉴定差异蛋白。结果构建的重组腺病毒AD-TP257能有效感染Huh7细胞并大量表达TP257蛋白。Huh7细胞感染ADTP257后以IFN-α处理,并通过免疫沉淀筛选到4种差异蛋白,其中3种经肽质量指纹图谱鉴定分别为热休克蛋白60、组蛋白HIST1H2BC和肌凝蛋白调节轻链12A。结论TP257抗IFN—α效应可能与它和特定肝细胞蛋白结合并相互作用有关。     

乙型肝炎病毒对人肝癌细胞脂类代谢相关蛋白表达的影响

目的 从mRNA水平和蛋白水平检测乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)对人肝癌细胞脂类代谢相关蛋白表达的影响。方法 以HBV细胞株或以1.2倍体HBV基因组瞬时转染人肝癌细胞株,采用实时定量PCR和Western blot方法验证人肝癌细胞载脂蛋白AI(apolipoprotein A-I,ApoAI)、载脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD 2)、NADPH脱氢酶(醌)1(NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1,NQO 1),以及肝型脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein 1,FABP 1)和乙酰辅酶A乙酰转移酶2(acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2,ACAT 2)等脂类代谢相关蛋白表达水平的改变。结果 HBV细胞株或瞬时转染HBV均使人肝癌细胞SOD 2、NQO 1基因的mRNA和蛋白表达量下调,FABP 1基因的mRNA和蛋白表达量上调。结论 HBV可影响人肝癌细胞脂类代谢相关蛋白表达,为HBV致肝细胞脂肪变机制的深入研究打下良好基础。     

跨学科交流提高基础医学研究生创新能力初探

加快创新型人才培养,大力提高研究生创新能力,是高等医学院校研究生教育的重要任务。文章以当前研究生教育现状为落脚点,展开分析与思考,提出通过多举措搭建跨学科学术交流平台等具体做法,提升研究生创新能力,探讨基础医学创新型人才培养的有效路径,为基础医学专业研究生创新教育提供思路。