构建不同筛选特性的HBV X基因真核表达载体

目的:构建不同筛选特性的两个HBV X基因真核表达载体.方法:从质粒pEcob6中PCR扩增HBV X全基因,利用pCEP4和pcDNA3.1( )两者多克隆位点的特点,选用pGEM(R)-T Easy Vector构建中间载体pEasy-X,分别酶切后连接特异性片段构建载体pCEP4-X和pcDNA3.1( )-X.结果:从质粒pEcob6成功PCR扩增出HBV X全基因并克隆至质粒pEasy-X,酶切、PCR及测序均证实真核表达载体质粒pCEP4-X和pcDNA3.1( )-X构建成功.结论:具有不同筛选特性的两个HBVX基因真核表达载体业已成功构建.     

靶向整合于MHCC 97-H细胞的HBx基因shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向整合于人肝癌MHCC97-H细胞乙型肝炎病毒x基因(HBxgene)基因的shRNA真核载体。方法依据从人肝癌细胞株MHCC97-H中克隆的HBx基因序列,设计合成X169、X220及MOCK(无关对照)3对寡核酸,经退火成互补双链并克隆至pGenesil-Ⅰ载体;经酶切、PCR和测序鉴定;将鉴定的shRNA质粒脂质体转染MHCC97-H细胞,流式细胞分析转染效率。结果酶切、PCR及测序证实pshRNA-X169/X220/MOCK质粒构建符合设计,转染48h后MHCC97-H细胞可激发绿色荧光,pshRNA-X220转染效率最低。结论成功构建靶向整合于人肝癌细胞HBVx基因特异性shRNA表达载体,并成功转染人肝癌细胞株MHCC97-H细胞,为沉默HBx基因实验性肝癌基因治疗奠定基础。     

肝病患者血浆皮质醇及其尿中代谢产物的变化

肝脏是许多重要激素作用的靶器官,也是激素降解、排泄和转化的主要部位。肝病时,由于肝细胞变性、坏死,可使皮质醇代谢引起紊乱。我们观察了65例肝病患者血浆皮质醇,尿17-羟皮质类固醇和尿17-酮类固醇的变化,并探讨其与肝功能变化的关系及临床意义。     

检测血清胆汁酸及天冬氨酸氨基转移酶在乙型肝炎肝硬化并腹水患者中的意义

目的探讨检测肝炎肝硬化并腹水患者中与肝脏病情关系相关的血清生化指标的意义.方法将126例乙肝病毒感染致肝硬化并腹水患者按Child-Pugh肝功能评分法评分并分级,对各级患者的丙氨酸氨基转移酶(ALT) 、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、胆汁酸(TBA)的阳性率行χ2检验,对其均值行t检验.结果所有患者中A级15例,B级73例,C级38例,它们的血清ALT、AST、TBA阳性率依次为39.6%、 84.2%、 93.3%,χ2值依次为2.0412、11.011、34.4112,P值依次为0.25～0.5、<0.005、<0.005;ALT均值C级与A级比较,明显升高(P=0.006),而在A级与B级间比较差异无显著性(P=0.151),AST在A级与B级、B级与C级、C级与A级间比较P值依次为0.000、0.049、0.000,TBA 在A级与B级、B级与C级、C级与A级间比较P值依次为0.000、0.032、0.000.结论在肝炎肝硬化并腹水患者中,按Child-Pugh肝功能评分法评分并分级后,血清AST及TBA数值与肝功能分级有良好的相关性.     

802例乙型肝炎患者血清HBeAg/HBeAb和HBVDNA定量分析

目的分析时间分辨免疫荧光（TRFIA）定量测定的HBeAg/HBeAb水平与HBVDNA复制水平的相关性及HBeAg/HBeAb血清转换作为HBV复制下降标志的可靠性.方法对同日定量测定血清HBV DNA和HBeAg/HBeAb的802例各种HBeAg/HBeAb类型乙肝病例均比较其DNA阳性率和复制水平,并对DNA阴性和阳性者比较其HBeAg和HbeAb水平,同时进行HBeAg或HBeAb与DNA水平的相关性分析.结果HBeAg阳性者DNA阳性率和复制水平高于HBeAg阴性者,HBeAb阴性者DNA阳性率和复制水平高于HBeAb阳性者,HBeAg阳性的患者其HBVDNA阳性率和复制水平均比HBeAb阳性者高;DNA阳性者HBeAg水平高于DNA阴性者,HbeAb水平则低于后者;DNA水平与HBeAg正相关而与HBeAb负相关.结论TRIFA定量测定的血清HBeAg/HBeAb与HBVDNA复制水平具有良好相关性,HBeAg/HBeAb血清转换是HBV复制下降的较可靠标志.     

乙肝病毒X基因真核表达载体pEGFP-X的构建及其表达

目的：构建pEGFP—X真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法：从质粒pcDNA3．1（＋）-X酶切获HBVX基因片段,克隆至pEGFP—N1;用酶切、PCR和测序鉴定pEGFP—X载体;用脂质体法,将重组载体（pEGFP—X）和空载体（pEGFP-N1）瞬时转染肝癌细胞细胞株BEL-7402;分别用RT—PCR、荧光显微镜鉴定HBVX和EGFP基因表达。结果：鉴定证实pEGFP-X载体构建成功;该质粒瞬时转染的BEL-7402有HBVX基因表达,并发绿色荧光。结论：构建的pEGFP—X真核载体能在BEL-7402中表达,绿色荧光蛋白示踪利于表达HBVX基因稳定细胞株的筛选,并为探讨HBVX基因在HCC中的致瘤机理提供实验模型奠定基础。     

一起严重的艾滋病毒职业暴露处理经过及分析

随着我国艾滋病毒（human immunodefieieney virus,HIV）感染者和艾滋病（human immunodefieieney syndrome,MDS）发病率的不断上升,到医院就诊的HIV感染者和AIDS病人逐渐增多。医务人员在施行诊断和治疗处理时,不可避免地接触到HIV污染的血液、体液或组织。避免HIV职业感染及暴露后的正确规范处理是值得研究的重要问题。本文报告1例严重HIV职业暴露,由于处理得十分规范和及时,完全符合有关的职业暴露后处理的程序和措施,有效地避免了一次危险的职业感染事故。     

尿铜在肝豆状核变性诊断中的意义

尿铜是诊断肝豆状核变性（Wilson disease，WD）的重要指标之一。然而，尿铜增加并非WD所特有。不同尿铜水平对于WD诊断的意义是一个尚未完全解决的问题。近年来我们就这一问题进行了系统的研究，现将结果报告如下。     

两个不同筛选特性的表达HBV X基因肝癌细胞模型的建立

目的：构建两个不同筛选特性的表达HBV X基因肝癌细胞模型。方法：应用脂质体介导转染克隆有HBV X全基因真核表达载体pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X入肝癌细胞HepG2,hygromycin和neomycin筛选单细胞克隆,传代培养一定时期后应用PCR,RT-PCR和Western blot方法鉴定HBV X基因的表达。结果：转染后成功筛选出耐hygromycin或neomycin的单细胞克隆,并能传代培养一定时期。PCR,RT-PCR和Western blot结果显示HBV X基因获得表达。结论:成功构建不同筛选特性的两个HBV X基因表达肝癌细胞模型。     

应用短发夹状RNA研究HBV X 基因表达对三氧化二砷诱导HepG2细胞凋亡特性的影响

目的应用shRNA(短发夹状RNA)介导的RNA干扰研究HBV X基因表达对三氧化二砷(As2O3)诱导HepG2细胞凋亡特性的影响.方法用噻唑蓝(MTT)还原法分析经2.0μmol/L As2O3处理的HepG2细胞和表达HBV X基因的HepG2-X细胞的生长抑制率.以未处理细胞为对照,流式细胞术分析细胞凋亡比和细胞周期,采用Caspase3/cpp32活性比色试剂盒测定As2O3处理后细胞裂解物中Caspase3的活性.应用脂质体介导HBX序列特异性shRNA表达载体pXi-1、pXi-2和序列无关对照pXi-3转染HepG2-X,再次分析细胞凋亡比、细胞周期和Caspase3活性的变化.结果MTT法表明2.0μmol/L As2O3处理36小时具有理想的细胞生长抑制率.As2O3作用后细胞凋亡比明显增高(P＜0.05),G2/M期细胞增多(P＜0.05).不同HBV X基因表达水平的细胞As2O3诱导的细胞凋亡比有统计学差异(P＜0.05),HepG2-X与HepG2比较,其As2O3诱导的细胞凋亡比下降,且细胞裂解物的Caspase3活性下降(P＜0.05),但应用序列特异性shRNA抑制HBV X基因表达后凋亡比和Caspase3活性可再次增高,而作为对照的序列无关的shRNA则无此效应,但这种效应与细胞周期无关.结论As2O3可诱导HepG2细胞凋亡.表达HBV X基因后As2O3诱导的HepG2细胞凋亡比和Caspas3活性下降,特异性shRNA抑制HBV X基因表达后则无此效应,但这种效应与细胞周期无关.