达依泊汀α在维持性血液透析患者中单次静脉给药的安全性和耐受性

目的 评估长效红细胞生成素达依泊汀α在维持性血液透析（MHD）患者中单次静脉给药的安全性和耐受性。 方法 采用单中心、开放性临床试验方法。选择MHD 3个月以上,病情稳定的患者43例,其中男26例,女17例,分为5个剂量组,分别给予达依泊汀α 0.225、0.45、0.9、1.8、3.6 μg/kg单次静脉注射,观察给药前后患者的生命体征、临床症状、心电图（ECG）和生化指标等变化,评价其安全性和耐受性。 结果 达依泊汀α的最大耐受剂量达3.6 μg/kg。与达依泊汀α可能有关的不良反应为高血压加重（7％）。1例出现严重不良事件（患者死亡）,但与达依泊汀α无关。观察期间未发现与达依泊汀α相关的严重不良反应。 结论 达依泊汀α的安全性和耐受性良好。     

未折叠蛋白反应参与小鼠急性肾缺血/再灌注损伤

目的 探讨未折叠蛋白反应(UPR)在小鼠急性肾缺血/再灌注损伤中的作用.方法 将C5786小鼠分为正常、假手术组和0、4、12、24 h手术组(分别于术后0、4、12和24 h处死小鼠),留取各组小鼠的左侧肾脏.苏木精一伊红(H-E)、过碘酸雪夫反应(PAS)和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)染色观察各组肾脏组织学变化,Western印迹法和实时聚合酶链反应(PCR)检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和caspasel2在各组小鼠肾组织中的表达.结果 H-E、PAS染色可见24 h手术组的肾小管上皮细胞坏死明显,病变最重的部位为外髓外带近端小管,肾小管坏死评分为(2.930 0±0.131 1)分,显著高于其他组(P值均<0.01).TUNEL染色可见24 h手术组的肾小管上皮细胞凋亡指数为(36.17±7.53)%,显著高于其他各组(P值均<0.01).Western印迹法.结果 显示,12 h手术组的GRP78和caspase12蛋白水平显著高于其他各组(P值均<0.01).实时PCR.结果 显示,4 h手术组的GRP78和caspasel2 mRNA水平显著高于其他各组(P值分别<0.01、0.05).结论 在夹闭左侧肾动脉致急性肾缺血/再灌注损伤模型中,小鼠左侧肾脏组织学损伤显示再灌注后24 h最严重.GRP78和caspasel2在再灌注后其mRNA和蛋白表达水平明显升高或激活,其变化早于组织学改变.提示UPR可能在急性肾缺血/再灌注损伤中发挥重要作用.     

罗格列酮对人多囊肾囊肿衬里上皮细胞增殖的抑制作用

Objective To investigate the antiproliferative effect of rosiglitazone, a thiazolidinedione (TZD) on autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) cystic lining epithelial cells and to explore the underlying molecular mechanism. Methods ADPKD cysticlining immortalized epithelial (WT9-12) cells were stimulated by rosiglitazone with different concentrations. After treatment, MTT method was performed to detect the level of proliferation; flow cytometry was used to determine the cell cycle distribution and the apoptosis rate. Western blotting was used to detect the protein expressions of mTOR, p70S6K, 4E-Bp1, PPARγ PPARγ siRNA was transfected into WT9-12 cells to knock down the expression of PPARγ Results Treatment of WT9-12 cells with rosiglitazone resulted in a dose-dependent and time-dependent strong inhibition of cell proliferation, an accumulation of cells in the G0/G1 phase (rosiglitazone 50 μmol/L 65.43%,rosiglitazone 100 μmol/L 64.02%, control 49.65% ) and 6% apoptosis at high concentration (rosiglitazone 200 μmol/L). Rosiglitazone reduced the phosphorylation of p70S6K in a dosedependent and time-dependent manner. The levels of phosphorylated mTOR and 4E-Bp1, the latter being a downstream substrate of mTOR related mRNA translation initiation, were not changed by rosiglitazone. Cells were pre-incubated with GW9662, a PPARγ antagonist, before the treatment with rosiglitazone, the inhibition of p70S6 kinase phosphorylation by rosiglitazone was partially prevented by GW9662 (P＜0.01). Then PPARγ siRNA was transfected into WT9-12 cells, in contrast to untransfected control or cells transfected with an irrelevant siRNA, rosiglitazone did not cause an obvious inhibition of p70S6 kinase phosphorylation in PPARγ knock-down.Conclusion Rosiglitazone inhibits the proliferation of ADPKD cystic lining epithelial cells, and down-regulates p70S6 kinase phosphorylation through mTOR-independent and PPARγ-dependent signal pathway.     

早期应用低蛋白加α酮酸饮食对延缓KK—Ay小鼠糖尿病肾病进展的作用

目的：观察早期应用低蛋白加α酮酸饮食对2型糖尿病肾病动物模型KK—Ay小鼠肾脏病变的影响,并探讨其作用机制。方法：雄性KK—Ay小鼠30只,12周龄开始给予不同饮食干预,分为正常蛋白组（22％酪蛋白,NPD组）15只和低蛋白加α酮酸组（5％酪蛋白＋1％a酮酸,Keto组）15只;另设性别周龄相同的C57／BL6J小鼠15只为对照（CON组）,始终给予正常蛋白饮食。检测第8、14、20周龄各组小鼠尿白蛋白,血清中葡萄糖、胰岛素、糖化血红蛋白、胆固醇、三酰甘油、尿素氮、肌酐、白蛋白等生化变化。对20周龄小鼠肾组织病理进行图文分析和半定量检测,免疫组化方法测定肾组织中TGF—β．FN表达量。结果：Keto组小鼠14周龄时血糖、ACR（白蛋白／肌酐）、尿白蛋白排泄率、三酰甘油低于NPD组（P〈0．05）,20周龄时糖化血红蛋白、血胰岛素、肾小球面积及系膜区面积显著降低（P〈0．05）。免疫组化结果显示NPD组小鼠肾内TGF—β蛋白表达及肾小球FN沉积明显增多（P〈0．05）。结论：早期应用低蛋白加α酮酸饮食能够显著降低KK—Ay小鼠尿白蛋白,减轻系膜基质增生和结节性硬化,而不引起营养不良,并可能通过减少TGF-β表达抑制FN等系膜基质增加而延缓糖尿病肾病的进展。     

人PPAR-γ及RXR-α全长质粒的构建及其肾脏细胞共转染体系的建立

本研究希望通过成功构建人PPAR-γ（hPPAR-γ）和RXR-α全长质粒,并建立人肾脏细胞系共转染体系,为研究hPPAR-γ及其激动剂在肾脏疾病的作用及机制奠定基础。     

罗格列酮对人多囊肾囊肿衬里上皮细胞增殖的抑制作用

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）激动剂罗格列酮对常染色体显性遗传性多囊肾病（ADPKD）囊肿衬里上皮细胞增殖的抑制作用及其机制。 方法 MTT法检测罗格列酮对ADPKD囊肿衬里上皮细胞系（WT9-12）细胞增殖的作用;流式细胞术检测罗格列酮对WT9-12细胞周期及凋亡的影响;Western印迹法检测罗格列酮对哺乳类动物的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）-p70核糖体S6激酶（p70S6K）信号通路的影响。给予PPARγ特异性抑制剂GW9662及PPARγ siRNA瞬时转染WT9-12细胞,检测罗格列酮对细胞增殖及对mTOR信号通路的作用是否为PPARγ依赖性的。 结果 罗格列酮抑制WT9-12细胞增殖,此作用在0~200 &#61549;mol/L范围内呈剂量依赖性及时间依赖性,作用72 h的50%抑制率浓度为100 &#61549;mol/L。细胞周期分析显示,罗格列酮（50、100 &#61549;mol/L）作用后,G0/G1期细胞较对照组显著增多（65.43%、64.02%比49.65%,P ＜ 0.05）。50、100 &#61549;mol/L罗格列酮对细胞凋亡影响不大,高浓度（200 &#61549;mol/L）罗格列酮可使凋亡细胞达6%（正常对照组为4%）。罗格列酮可呈时间及剂量依赖性下调WT9-12细胞p70S6K磷酸化表达,而对mTOR及其另一个下游4E结合蛋白1（4E-BP1）磷酸化水平无明显影响。加入GW9662及转染PPARγ siRNA阻断PPARγ表达后,可部分阻断罗格列酮对p70S6K磷酸化的影响（P ＜ 0.01）。 结论 罗格列酮可抑制ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖和阻滞细胞周期,可不依赖于mTOR途径直接下调p70S6K磷酸化表达。罗格列酮对ADPKD囊肿衬里上皮细胞p70S6K磷酸化的影响是PPARγ依赖性的。     

塞来昔布对多囊肾囊肿衬里上皮细胞增殖及细胞周期的影响

环氧化酶-2（COX-2）的表达除与已知的炎症反应有关外，其在肿瘤的发生发展中也起重要作用。动物实验及流行病学资料表明，COX-2特异性抑制剂塞来昔布可有效抑制结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌等肿瘤的发生发展。多囊肾囊肿衬里上皮细胞具有类似良性肿瘤的高增殖抒性，如能抑制其增殖活性，则可阻止囊肿的产生与长大，达到干预性治疗的目的。本研究观察了塞来昔布对囊肿衬里上皮细胞增殖及周期的影响，并初步探讨其作用机制。     

罗格列酮对人多囊肾囊肿衬里上皮细胞增殖的抑制作用

Objective To investigate the antiproliferative effect of rosiglitazone, a thiazolidinedione (TZD) on autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) cystic lining epithelial cells and to explore the underlying molecular mechanism. Methods ADPKD cysticlining immortalized epithelial (WT9-12) cells were stimulated by rosiglitazone with different concentrations. After treatment, MTT method was performed to detect the level of proliferation; flow cytometry was used to determine the cell cycle distribution and the apoptosis rate. Western blotting was used to detect the protein expressions of mTOR, p70S6K, 4E-Bp1, PPARγ PPARγ siRNA was transfected into WT9-12 cells to knock down the expression of PPARγ Results Treatment of WT9-12 cells with rosiglitazone resulted in a dose-dependent and time-dependent strong inhibition of cell proliferation, an accumulation of cells in the G0/G1 phase (rosiglitazone 50 μmol/L 65.43%,rosiglitazone 100 μmol/L 64.02%, control 49.65% ) and 6% apoptosis at high concentration (rosiglitazone 200 μmol/L). Rosiglitazone reduced the phosphorylation of p70S6K in a dosedependent and time-dependent manner. The levels of phosphorylated mTOR and 4E-Bp1, the latter being a downstream substrate of mTOR related mRNA translation initiation, were not changed by rosiglitazone. Cells were pre-incubated with GW9662, a PPARγ antagonist, before the treatment with rosiglitazone, the inhibition of p70S6 kinase phosphorylation by rosiglitazone was partially prevented by GW9662 (P＜0.01). Then PPARγ siRNA was transfected into WT9-12 cells, in contrast to untransfected control or cells transfected with an irrelevant siRNA, rosiglitazone did not cause an obvious inhibition of p70S6 kinase phosphorylation in PPARγ knock-down.Conclusion Rosiglitazone inhibits the proliferation of ADPKD cystic lining epithelial cells, and down-regulates p70S6 kinase phosphorylation through mTOR-independent and PPARγ-dependent signal pathway.     

塞来昔布诱导多囊肾囊肿衬里上皮细胞凋亡的实验研究

目的 通过观察特异性环氧酶2(COX-2)抑制剂塞来昔布(celecoxib，CXB)诱导人多囊肾囊肿衬里上皮细胞凋亡，初步探讨该药诱导细胞凋亡的作用机制。 方法 (1)原代培养囊肿衬里上皮细胞，分为对照组、CXB组，采用Brdu法检测细胞增殖状态。(2)应用透射电镜观察细胞超微结构。(3)TUNEL法检测细胞凋亡及凋亡率。(4)应用AnnexinV+流式细胞术检测CXB诱导细胞凋亡及凋亡率。(5)应用免疫印迹法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达。 结果 (1)Brdu结果显示，CXB能抑制多囊肾囊肿衬里上皮细胞的增殖，在24~72 h，浓度为(0.25~2)×10^-5 mol/L的范围内呈时间和剂量依赖性。(2)电镜下可见细胞核浓缩、染色质聚集、胞浆空泡化、凋亡小体出现、沟裂和裸核形成等典型凋亡征象。(3)TUNEL法显示，对照组细胞凋亡率为(2.8±0.2)%，2×10^-5 mol/L CXB作用24、48 h细胞凋亡率为(28.5±1.6)%和(48.5±1.2)%，两者差异有统计学意义(P < 0.05)。(4) AnnexinV+流式细胞仪法结果显示，不同浓度(0.5、1、2×10^-5 mol/L)CXB处理24 h凋亡率分别为(7.15±0.11)%、(7.76±0.08)%和(12.15±0.07)%，显著高于无血清对照组(3.15±0.05)%；不同浓度CXB处理48 h的凋亡率分别为(18.36±0.17)%、(24.87±0.25)%和(53.66±0.32)%，显著高于无血清对照组(13.53±0.21)%，组间差异均有统计学意义(P 均< 0.01)。(5)Western 印迹结果显示，随CXB作用时间延长，Bcl-2的表达逐渐减弱而Bax的表达逐渐增强，Bcl-2/Bax的比值逐渐减少。结论 塞来昔布呈时间和剂量依赖性抑制囊肿衬里上皮细胞增殖，通过下调Bcl-2，上调Bax，减少Bcl-2/Bax的比值诱导细胞凋亡。本研究结果为将CXB用于治疗常染色体显性多囊肾病提供了实验依据。     

膜联蛋白Ⅱ基因短发夹RNA表达载体的构建和鉴定

目的:构建针对膜联蛋白(annexin)Ⅱ的短发夹RNA(shRNA)的表达载体,观察其对目的基因表达的影响.方法:根据GenBank中annexinⅡ基因已知序列设计了2条序列,即annexinⅡshRNA1、annexinⅡshRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照.据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接人pGenesil1载体,转化扩增后进行序列测定.3种重组表达载体均转染HEK293细胞,通过实时荧光定量RT-PCR和Western印迹法分别在基因和蛋白水平上检测各自annexinⅡ的表达,以未转染细胞作为空白对照.结果:3种重组表达载体(pGenesil1-annexinⅡshRNA1、pGenesil1-annexinⅡshRNA2和pGenesil1- negative shRNA)经限制性酶切及测序分析证明基因插入正确.转染HEK293细胞后,转染pGenesil1-annexinⅡshRNA2组细胞annexinⅡ基因和蛋白表达明显低于转染pGenesil1-annexinⅡshRNA1、pGenesil1-negative shRNA以及空转染细胞(P＜0.05),而后三者间没有明显差异.结论:成功构建了针对annexinⅡ的shRNA表达载体(pGenesil1-annexinⅡshRNA2),转染细胞后可抑制annexinⅡ基因表达.