沉默树突状细胞恒定链以增强其抗肿瘤作用的体外实验研究

目的初步观察用小分子干扰RNA(siRNA)沉默树突状细胞(DCs)恒定链(Ii)后,DCs疫苗的体外抗肿瘤效果。方法从小鼠骨髓分离骨髓前体细胞,细胞经100 ng/ml GM-CSF和100 ng/ml IL-4诱导培养6 d后,转染针对DCs Ii链特异的Ii-siRNA,转染后加用50 ng/ml TNF-α继续诱导细胞成熟48 h,然后分别用Western blot检测沉默效果及CCK-8试剂盒检测DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;此外,DCs共转染Ii-siRNA和小鼠胃癌前体细胞MFC的总RNA后,与同种异体淋巴细胞共培养,通过ELISA检测培养上清IFN-γ/和IL-4的水平,并收集致敏淋巴细胞进行体外杀伤实验。结果Ii-siRNA明显抑制DCs Ii的表达。沉默Ii链能够增强DCs的淋巴细胞增殖能力,并促使淋巴细胞向Th1的方向漂移[IFN-γ:(5107±351)pg/ml,IL-4:(65±13)pg/ml,P＜0．05]。淋巴细胞经共转染Ii-siRNA和MFC RNA的DCs激活后,明显而特异地杀伤靶肿瘤细胞(杀伤百分率: 66．94%±2．75%,P＜0．05)。结论通过siRNA沉默DCs的Ii链可能是一种行之有效的增强抗肿瘤免疫的方法。     

POLO-LIKE KINASE1 GENE EXPRESSION AND ITS CLINICOPATHOLOGICAL SIGNIFICANCE IN GASTRIC CARCINOMA

Objective To clarify the polo-like kinasel （PLK1） expression in human gastric cancer tissue and its clinicopathological significance in gastric carcinoma. Methods PLK1 expression in 60 cancer tissues and their corresponding noncancerous tissues from gastric cancer patients was measured by both real-time quantitative RT-PCR and western blot assay, lmmunohistochemistry was used to detect PLK1 protein expression in eighty-nine paraffin-embedded samples. Results The PLK1 mRNA and protein expression level in the 60 fresh cancer tissues was significantly higher than that in noncancerous tissues （ P 〈 0. 0001, P = 0. 031 respectively）. In paraffin-embedded samples, apart from its increased expression level, PLK1 was found to be in both cytoplasm and nucleus, double-site location only occurred in poor-differentiated cancer, PLKI expression intensity was associated with tumor dif- ferentiation （ P = 0. 03）, invasion （ P = 0. 032 ）, TNM stage （ P = 0. 019） , ki67 expression （ P = 0. 011 ）. The patients with negative PLK1 expression had better survival rate than that with positive PLK1 expression （ P =0. 0292 ）. Conclusion PLK1 may have clinicopathological value in tumor diagnosis, and may become another new biomarker and therapeutic target for gastric cancer.     

体外RNA干扰抑制RegⅣ基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:拟探讨RegⅣ基因在胃癌细胞中的表达及干扰该基因对胃癌细胞增殖和凋亡的影响.方法:应用实时定量PCR方法检测九株胃癌细胞株中RegⅣ基因的mRNA表达. 针对RegⅣ基因设计三条小干扰RNA片段(siRNA1、siRNA2、siRNA3), 瞬时转染高表达胃癌细胞株, 实时定量PCR方法检测转染后RegⅣ基因的mRNA的表达水平, CCK-8法检测细胞增殖能力, 流式细胞仪检测细胞凋亡.结果:以永生化正常胃黏膜细胞株GES-1作为参照, 除MKN-45和SNU-1胃癌细胞株外, 其余胃癌细胞株中RegⅣ表达水平均升高5倍以上, 尤以SNU-16细胞株明显, 其RegⅣ的表达水平高出GES-1细胞数千倍, 遂选用SNU-16细胞进行RNA干扰. 合成的三对siRNA对RegⅣ基因表达均有明显抑制作用, 抑制率分别为79.3%、77.4%和60.4%. 选用siRNA1干扰SNU-16细胞株后96 h和120 h, 其细胞增殖率受到明显抑制( P = 0.0057, 0.0173). 流式细胞仪检测显示72 h细胞凋亡率明显增加( P =0.0231).结论:干扰RegⅣ基因具有抑制胃癌细胞增殖,促进凋亡的作用, RegⅣ基因可能成为胃癌基因靶向治疗的分子靶点.     

线粒体途径在温热化疗诱导胃癌细胞AGS凋亡中的作用

目的探讨线粒体途径在温热化疗诱导胃癌细胞AGS凋亡中的作用。方法应用人胃癌细胞株AGS,根据不同实验处理分为常温对照(NT)、单纯温热(HT)、常温化疗(NTCT)和温热化疗(HTCT)四组。Western blotting法检测AGS细胞中Bax、Bcl-2蛋白及其线粒体胞质蛋白中细胞色素C的表达,实时PCR检测其Bax、Bcl-2的mRNA表达;分别测定各组AGS细胞Caspase3和Caspase9的酶活性变化。结果与NT、HT、NTCT组比较,HTCT组AGS细胞Bcl-2蛋白表达下调而Bax蛋白表达上调,Bax/Bcl-2显著上升;线粒体胞质蛋白中细胞色素C表达增加;Caspase9和Caspase3的酶活性显著增高。结论HTCT可引起AGS细胞Bcl-2、Bax基因和蛋白表达水平发生改变,促使其细胞色素C由线粒体释放进入细胞质,从而诱导细胞凋亡。     

蛋白质组技术在胃癌相关标志物筛查中的应用

目的 建立胃癌组织和正常胃组织双向凝胶电泳图谱，鉴定差异表达蛋白，从中发现有意义的胃癌相关标志物。方法 采用双向凝胶电泳（2-DE）分离胃癌组织和正常胃组织总蛋白，银染显色，PDQuest软件分析，从中选取差异表达蛋白质点，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）或MALDI-TOF-TOF-MS鉴定差异表达的蛋白质。结果 获得重复性和分辨率较好的胃组织双向凝胶电泳图谱；发现23个差异表达蛋白质，其中15个得到鉴定，在肿瘤组织中高表达的有10个，其余5个在肿瘤组织中低表达。结论 建立了胃癌组织和正常胃组织双向凝胶电泳图谱，并应用质谱技术鉴定了15个差异表达蛋白质。     

胆固醇结石病人肝脏SRBI及其转录调节因子LRH-1基因表达的研究

目的:研究胆固醇结石病人BI型清除剂受体(scavengerreceptorBtypeI,SRBI)及其转录调节因子肝脏受体类似物1(liverreceptorhomologue1,LRH-1)的表达,以探讨胆固醇结石发病的机制。方法:对20例胆囊胆固醇结石病人和10例无胆石症对照者测定血清脂质、胆汁成分和计算胆汁胆固醇饱和指数。以实时定量PCR法测定肝脏SRBI和LRH-1mRNA的表达量。结果:胆石组胆石平均胆固醇含量(86.68±5.26)%,均为胆固醇结石。胆石组病人血清高密度脂蛋白(HDL)显著低于对照组[(0.86±0.62)mmol/L比(1.42±0.56)mmol/L,P<0.01]。胆石组胆汁胆固醇在总脂中的摩尔百分比和胆固醇饱和指数显著高于对照组[(7.80±2.06)mol%比(5.26±2.80)mol%,P<0.05]。胆石组SRBI基因mRNA表达量与对照组比较显著增高(2.48±0.44比1.00±0.23,P<0.05),胆石组LRH-1表达也高于对照组(2.05±0.29比1.00±0.28,P<0.05)。结论:胆固醇结石病的主要病理生理异常为胆汁胆固醇过饱和。肝脏LRH-1、SRBI表达增高,参与了胆固醇过饱和胆汁形成,并促进了胆固醇结石形成。     

结直肠癌γ-synuclein基因启动子CpG岛的去甲基化及其临床意义

目的 探讨结直肠癌中γ-synuclein基因的表达与启动子区CpG岛甲基化修饰之间的关系,以及γ-synuclein基因去甲基化水平与结直肠癌临床病理特征的关系.方法 采用半定量RT-PCR法检测30例结直肠癌和相应癌旁组织中γ-synuclein基因的表达及去甲基化试剂5-杂氮-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-C）干预对结直肠癌细胞COLO205、LoVo和SW480的γ-synuclein基因表达的影响.采用亚硫酸氢盐修饰测序（BSP）法检测5-Aza-C处理前后CpG岛的甲基化情况.采用巢式甲基化PCR（NMSP）及实时荧光定量MSP法检测67例结直肠癌组织和30例相应癌旁组织中γ-synuclein基因的甲基化状态,并分析其与临床病理特征的关系.结果结直肠癌组织中γ-synuclein mRNA的表达水平0.66±0.34,高于相应癌旁组织的0.45±0.26,差异有统计学意义（P=0.011）.5-Aza-C处理后,COLO205、LoVo和SW480细胞γ-synuclein mRNA表达水平明显上升,同时γ-synuclein基因启动子区CpG岛的甲基化水平明显降低.80.0%（24/30）的结直肠癌组织和50.0%（15/30）的相应癌旁组织的γ-synuclein基因被去甲基化,结直肠癌组织中γ-synuclein基因去甲基化的趋势明显强于相应癌旁组织（P=0.030）.γ-synuclein基因的去甲基化水平与结直肠癌的淋巴结转移、临床病理分期及远处转移有关.结论 结直肠癌中γ-synuclein基因的上调表达与启动子区CpG岛的去甲基化状态有一定关联,γ-synuclein基因的去甲基化水平有望成为结直肠癌患者判断预后的潜在标志物.     

TAGLN在胃癌组织中的表达及其与转移的关系

目的观察TAGLN在胃癌中的表达及其与肿瘤细胞侵袭转移能力的关系。方法运用实时PCR、Western blotting及免疫组化方法,检测TAGLN在40例胃癌患者肿瘤组织和相应癌旁组织、7株胃癌细胞株及癌相关成纤维细胞(CAFs)中的表达;分析TAGLN的表达与胃癌临床病理学之间的关系。运用细胞侵袭和移动试剂盒检测高表达TAGLN的CAFs或沉默TAGLN表达后的CAFs对胃癌细胞株MKN45侵袭及移动能力的影响。结果在mRNA和蛋白表达水平方面,各胃癌细胞株间无显著性差异(P>0.05);与相应癌旁组织相比,胃癌组织TAGLN的表达明显上调(P<0.05);免疫组化染色显示,TAGLN蛋白表达于胃癌组织间质中的成纤维细胞、新生血管内皮细胞及肿瘤浸润的黏膜肌层中的肌细胞,且主要表达于细胞膜和细胞浆。淋巴结转移组胃癌组织TAGLN蛋白的表达为3.751±0.681,显著高于无淋巴结转移组的1.084±0.328(P<0.05)。细胞侵袭和移动试验结果显示,高表达TAGLN的CAFs能够促进胃癌细胞株MKN45的侵袭及移动能力;而经siRNA沉默TAGLN表达后的CAFs则明显降低胃癌细胞株MKN45的侵袭及移动能力。结论TAGLN基因在胃癌组织的基质中高表达,其表达上调对胃癌的侵袭和转移可能具有促进作用。     

结直肠癌中Galectin-9的表达及其意义

目的：探讨Galectin-9基因和蛋白在结直肠癌中的表达及其临床意义。方法：运用荧光实时定量PCR及免疫组织化学染色方法检测45例手术切除的结直肠癌标本和20例正常结直肠上皮组织中Galectin-9基因和蛋白的表达，分析Galectin-9的表达与结直肠癌临床病理特征的关系。结果：Galectin-9基因在结直肠癌组织中表达低于正常结直肠上皮组织（P〈0．05），Galectin-9蛋白在结直肠癌组织中表达阳性率为62％，在正常结直肠上皮组织中表达阳性率为90％，差异具有统计学意义（P〈0．05）。Galectin-9的低表达与结直肠癌的远处转移相关（P〈0．05），与患者的年龄、性别、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、肿瘤分化程度、肿瘤分期及肿瘤部位无显著相关。结论：Galectin-9在结直肠癌中低表达，并且与肿瘤的远处转移相关，有可能成为结直肠癌判断预后的标志物以及基因治疗的潜在靶点。     

Demethylation of the γ-synuclein gene CpG island in colorectal cancer and its clinical significance

Objective To explore the relationship between γ-synuclein gene expression and CpG island demethylation in colorectal cancer (CRC), and the relationship between the demethylation and clinicopathological factors of CRC. Methods The expression of γ-synuclein mRNA was examined in 30 pairs of tumor tissues and tumor-matched non-neoplastic adjacent tissues (NNAT) by RT-PCR.CRC cell lines including COLO205, LoVo, and SW480 were used and treated with a demethylating agent, 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-C). Before and after the treatment, the expression of γ-synuclein mRNA in the cells was determined by RT-PCR, and bisulfite sequencing PCR was also used to analyze methylation status of CpG island. The methylation status of γ-synuclein was then examined in 67 CRC samples and 30 NNAT samples by nested methylation-specific PCR (NMSP) and real time methylationspecific PCR (real-time MSP). The relationship between the demethylation of γ-synuclein in CRC and clinicopathological factors was analyzed. Results The mean γ-synuclein mRNA expression was 0.66±0.34 in CRC samples, which was much higher than 0.45±0.26 in NNAT samples (P=0.011). 5-aza-C could induce expression and demethylation of γ-synuclein in COLO205, LoVo and SW480 cells. Γ-Synuclein gene was demethylated in 80.0%(24/30) of the CRC samples and 50.0%(15/30) of the NNAT samples.The demethylated status of γ-synuclein was much higher in CRC samples than that in NNAT samples (P=0.030), and was significantly correlated with clinical stage, lymph node involvement, and distant metastasis of CRC (P＜0.05). Conclusion The upregulation of γ-synuclein expression in CRC is primarily attributed to the demethylation of CpG island, which may be used as a marker for prognosis.