日本血吸虫视黄酸X受体2全长cDNA的克隆及初步分析

目的克隆编码日本血吸虫视黄酸X受体2(SjRXR2)蛋白的全长cDNA,并对其进行初步研究。方法利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得SjRXR2蛋白全长编码cDNA。利用生物信息学技术,对基因结构进行初步分析。利用实时荧光定量(Real time)PCR技术对该基因在日本血吸虫不同时期虫体中的转录情况进行分析。应用在线抗体表位预测软件获得SjRXR2配体结合区抗原性较强的一个多肽序列,合成该多肽片段,并免疫小鼠制备抗血清。利用Western blot技术分析该蛋白在日本血吸虫中的表达。结果采用RACE技术成功获得了SjRXR2蛋白全长编码cDNA,总长度为5 960bp,其完整开放阅读框为4 308 bp,编码1 435个氨基酸,预测分子量为159 kDa。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白质序列具有核受体家族2的典型结构域特征,且与曼氏血吸虫RXR2有较高的相似性。Real time PCR分析表明,该基因在21、42 d龄日本血吸虫虫体内有较高的转录水平。Western blot分析表明,小鼠SjRXR2多肽免疫血清可特异性识别日本血吸虫虫体150 kDa蛋白。结论成功获得了编码SjRXR2蛋白的全长cDNA,并制备了针对该蛋白的特异性多克隆抗体,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

日本血吸虫促凋亡基因SjBAD的初步研究

目的了解日本血吸虫促凋亡基因Sj BAD的生物学、免疫学和转录表达特征,评估Sj BAD重组蛋白作为日本血吸虫病疫苗候选分子的潜力。方法根据Sj BAD的参考序列设计引物,应用PCR技术扩增Sj BAD基因,构建重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj BAD。采用实时定量PCR检测Sj BAD基因在日本血吸虫不同发育期及42 d雌、雄虫体内的转录水平;应用Western blotting和间接ELISA法分析Sj BAD重组蛋白的抗原性和免疫原性。用重组抗原Sj BAD免疫BALB/c小鼠,通过计算减虫率及肝脏减卵率,评估重组抗原作为血吸虫病候选疫苗分子的潜力。结果成功克隆了日本血吸虫Sj BAD基因,构建了重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj BAD,并在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白分子量约为22 k Da。Western blotting表明Sj BAD具有较好的抗原性和免疫原性,间接ELISA法检测表明重组蛋白免疫小鼠产生了高水平的特异性抗体Ig G。实时定量PCR检测发现Sj BAD基因在日本血吸虫的各个发育阶段均有转录,以14 d表达量最高,且在雄虫体内的表达量高于雌虫。两次动物免疫试验表明,重组蛋白Sj BAD在BALB/c小鼠体内诱导了30.82%和27.87%的减虫率,及42.52%和45.84%的肝脏虫卵减少率,均显著高于PBS对照组(P均0.05)。结论成功克隆、表达了日本血吸虫促凋亡相关基因Sj BAD,该基因在日本血吸虫不同发育期虫体内均有表达。纯化的重组Sj BAD蛋白在小鼠体内能诱导产生部分抗血吸虫感染的免疫保护效果。     

3种保虫宿主日本血吸虫特征性差异表达基因的筛选与验证

目的筛选日本血吸虫3种重要保虫宿主来源虫体的特征性差异表达基因,寻找可以用于鉴别这3种宿主来源虫体的遗传标记。方法日本血吸虫尾蚴人工感染黄牛、水牛和山羊,收集感染后49 d成虫,分别抽提RNA,逆转录成cD NA,体外转录为cRNA并进行片段化;采用定制的血吸虫芯片分别进行杂交,筛选每种宿主来源虫体的特征性差异表达基因。采用实时定量PCR法对所筛选差异表达基因的表达水平做进一步测定,验证芯片数据的结果,并对这些特征性差异表达基因进行验证。结果通过芯片杂交,分析筛选获得实验黄牛组来源虫体特征性差异表达基因3个,水牛组来源虫体4个,山羊组来源虫体7个。其中黄牛组2个、水牛组3个、山羊组5个特征性差异表达基因在另一批次3种宿主来源虫体的重复试验中得到验证。结论芯片杂交筛选出10个3种宿主来源虫体的特征性差异表达基因,这些基因可能可以作为这3种不同宿主来源虫体的遗传标记。     

新西兰大白兔感染日本血吸虫不同时期内脏沉积虫卵特征与病理变化

目的 目的 观察感染日本血吸虫不同时间动物内脏中沉积虫卵的分布特征及组织病理变化。方法 方法 新西兰大白兔 定量人工感染血吸虫后, 比较感染后42、 60 d沉积虫卵在组织中的分布特征、 虫卵孵化率的变化以及相应部位的病理改 变。结果 结果 感染42 d时, 沉积虫卵百分比、 每克组织沉积虫卵数及沉积虫卵孵化率最高的均为肝脏; 感染60 d时, 上述3 个指标值最高的分别为肝脏、 直肠和小肠上段。从感染后42 d到60 d, 兔肝脏肿大, 且由黑色逐渐变成暗灰色并失去弹 性而硬化, 小肠各段逐渐出现虫卵结节, 结肠、 盲肠和直肠可见黏膜充血、 水肿、 结节, 病变程度与虫卵的沉积相关。结 结 论 论 新西兰大白兔感染日本血吸虫后不同时期, 不同器官组织的沉积虫卵数量、 密度及虫卵孵化率均有差异, 且沉积虫 卵的分布和宿主病理损伤程度有关。     

日本血吸虫TOM34基因的克隆和表达分析

目的 克隆、表达日本血吸虫线粒体外膜转运酶34基因(SjTOM34),并对其生物特性进行初步研究。方法 应用RT-PCR方法从42 d日本血吸虫成虫cDNA中扩增SjTOM34基因,并进行生物信息学分析。应用实时定量RT-PCR方法分析了SjTOM34基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达状况。构建了SjTOM34基因重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达,Western blotting分析了重组抗原的免疫原性及该蛋白在不同发育阶段虫体中的表达情况,利用免疫组化方法观察了该蛋白在虫体内的分布情况。结果 获得了SjTOM34的基因序列,其开放阅读框(ORF)为1 083 bp。该基因在所检测的不同发育阶段童虫和成虫中均有表达,其中在35 d虫体中的表达量略高于其他时期的虫体。成功构建了重组的原核表达质粒并且在大肠杆菌中获得表达,重组蛋白在上清和沉淀中都有存在,并且具有较好的免疫原性,在所检测的各时期虫体中均可检测到该蛋白的存在,并且主要分布在虫体的实质组织中。结论 获得了日本血吸虫SjTOM34基因,初步明确了该基因在日本血吸虫童虫和成虫中的表达情况,及在成虫中的分布。     

日本血吸虫SjIM基因克隆表达及动物免疫保护评估

目的 克隆并表达日本血吸虫肌醇单磷酸酶(SjIM)编码基因cDNA,评估该重组抗原抗血吸虫感染的免疫保护效果.方法 以日本血吸虫42d虫体cDNA为模板,经PCR扩增编码SjIM蛋白的开放阅读框(ORF)基因片段.采用荧光实时定量PCR分析该基因在童虫和成虫的表达情况.以pET28a(+)为载体构建重组表达质粒,经异丙基- β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导,制备重组SjIM蛋白.Western blotting检测重组蛋白的抗原性与免疫原性,利用重组SjIM抗原免疫小鼠评估其免疫保护效果.结果 获得了编码SjIM基因ORF的cDNA片段,ORF长度为834 bp,编码278个氨基酸.荧光实时定量PCR显示该基因在35 d虫体中表达量最高.获得了SjIM重组蛋白,其具有良好的免疫原性.免疫组小鼠获得48.76％的减虫率和41.29％的肝脏减卵率.结论 获得了日本血吸虫SjIM基因ORF的cDNA序列,并制备了重组SjIM蛋白,该重组抗原在小鼠体内能诱导产生部分抗血吸虫感染的免疫保护效果.     

日本血吸虫凋亡诱导因子SjAIF功能区片段的克隆及表达分析

目的 克隆表达日本血吸虫凋亡诱导因子(SjAIF)功能区片段,并对其生物学特性进行初步分析。方法 应用PCR技术扩增日本血吸虫凋亡诱导因子的功能区片段,构建原核重组表达质粒并诱导其表达,实时定量PCR分析其在不同发育时期童虫和成虫的转录水平,通过Western-blot和间接ELISA法分析重组蛋白的抗原性和免疫原性,应用免疫组化分析该蛋白在虫体内的分布情况。结果 克隆了SjAIF功能区片段,大小为831 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET-28a(+)-SjAIF,并在大肠杆菌中获得表达,重组蛋白分子量35 kD。实时定量PCR分析表明SjAIF基因在童虫和成虫的各个发育阶段均有转录,其中7 d~21 d虫体表达量较低,42 d和28 d虫体表达量较高,雌虫表达量高于雄虫。重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原性,免疫小鼠后诱导产生了较高水平的特异性IgG抗体。该蛋白主要存在于日本血吸虫体被,少部分分布于实质组织中。结论 成功表达了SjAIF基因的功能区片段,对其生物学特性进行了初步分析,为进一步研究该基因生物学功能和作用提供了基础。     

诊断家畜日本血吸虫感染胶体金免疫层析试纸条的研制

目的 目的 研制一种可用于疫区现场快速诊断家畜日本血吸虫感染的胶体金免疫层析试纸条。方法 方法 设计重组蛋 白G并在大肠杆菌中表达, 得到重组蛋白。对重组蛋白G进行胶体金标记并制备金标垫, 分别用可溶性虫卵抗原 （SEA） 和重组蛋白G划线, 作为检测线和质控线。采用组装的试纸条检测标准阴、 阳性BALB/c鼠与新西兰大白兔血清, 以及粪 检阴、 阳性的绵羊与水牛血清, 评估其灵敏度和特异度; 利用组装的试纸条检测前后盘吸虫病病牛血清, 评价其交叉反应 性。结果 结果 成功构建了重组蛋白G的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达。以重组蛋白G制备的试纸条可用于检测日本 血吸虫感染BALB/c鼠、 新西兰大白兔、 水牛、 绵羊血清抗体。该试纸条检测日本血吸虫感染小鼠与兔血清的灵敏度、 特 异度均为100%; 检测绵羊血清的灵敏度为100%, 特异度为88.46%; 检测水牛血清的灵敏度为94.44%, 特异度为100%; 其与前后盘吸虫交叉反应率为5.88%。结论 结论 成功研制能检测多种家畜血吸虫病的胶体金免疫层析试纸条, 其检测家 畜血吸虫感染的灵敏度和特异度均较高。     

血吸虫核受体的研究进展

核受体在后生动物中作为一类重要的转录调控因子,在一系列重要的生化过程中发挥重要的作用,包括细胞分化和增殖。核受体含共有的蛋白结构,包含一个N端-A/B区, 一个 高度保守的 DBD, 一个铰链区(D 区)和一个C-端 LBD区。到目前为止,寄生扁形动物中的核受体,只在曼氏血吸虫和日本血吸虫中有报道。本文对近年来血吸虫的核受体的研究成果做简要综述,以为今后更进一步的研究提供参考。     

日本血吸虫新基因Sjnanos的克隆、表达及免疫保护效果评估

目的扩增、表达日本血吸虫Sjnanos编码基因并评估其重组蛋白诱导的免疫保护效果。方法从42d龄的日本血吸虫成虫中扩增了一个日本血吸虫性别差异表达的基因,GenBank登录号为AY814948,并对其进行生物信息学分析。将该基因亚克隆入原核表达载体pET28a,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠,ELISA检测其血清特异性抗体效价,蛋白印迹分析检测其抗原性,以看家基因NADH为内参,应用荧光定量PCR技术分析该基因在血吸虫各个阶段的表达状况。结果同源性分析表明,该基因为日本血吸虫的一个新基因,其编码序列的开放阅读框(ORF)为525bp,编码174个氨基酸,理论相对分子量为19.9,PI为8.2。荧光定量PCR技术分析显示该基因在7d、13d、18d、23d、32d、42d虫体均有表达,但在18d和13d虫体的表达量明显高于其他天数的虫体,在雄虫的表达量高于雌虫。成功构建了该基因的重组表达质粒pET28a(+)-Sjnanos,并在大肠埃希菌中获得表达,Western-blot分析表明重组蛋白具有较好的免疫原性,动物免疫保护试验获得了31.4%的减虫率和53.8%的肝脏减卵率。结论获得日本血吸虫新的抗原基因Sjnanos,该基因的重组蛋白在小鼠中诱导了部分免疫保护作用。