汉坦病毒A9株全长L片段cDNA克隆和核苷酸序列测定

目的克隆我国分离的汉坦病毒A9株L片段全长cDNA,并测定其核苷酸序列.方法用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术分段扩增汉坦病毒A9株全部L片段,用T-A克隆方法进行PCR产物克隆,测定PCR产物的核苷酸序列.通过亚克隆将分段的L片段连接成全长cDNA克隆.结果A9株的基因组L片段长度为6533个核苷酸,腺嘌呤核苷酸和尿嘧啶核苷酸丰富(%A+U=62.47).包含有一个单一的开放读码框架(ORF),编码一个标准的质量为2.46×105的蛋白,含有2151个氨基酸.A9株与76-118、C1-1和C1-2株的同源性最高,达到83.8%.与TULA病毒的关系较远,其核酸序列的同源性为65.8%.将推导的A9株编码的氨基酸序列与其他21种负链RNA病毒的依赖RNA的RNA聚合酶的氨基酸序列以及汉坦病毒几个代表株的L片段氨基酸序列进行比较,显示A9编码的RNA聚合酶也有6个比较保守的区域以及几个极端保守的氨基酸残基.结论汉坦病毒A9株L片段具有和其他汉坦病毒RNA聚合酶相似的核苷酸一级结构,通过对推导的氨基酸分析,该片段具有一些在RNA病毒聚合酶中都存在的保守区域.     

人源腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段及其全抗体的研制

目的 运用噬菌体表面表达技术，获得基因工程抗腺病毒伴随病毒抗体Fab、IgG。方法 从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞。提取总RNA，逆转录cDNA，聚合酶链反应扩增人IgG Fab轻、重链基因，利用pComb3载体构建噬菌体抗体库。用纯化的腺病毒伴随病毒为固相抗原筛选抗体Fab段，并在E.coli中进行分泌性表达。通过ELISA和间接免疫荧光试验、筛选和鉴定Fab抗体，并进行序列测定。然后将其重链和轻链基因克隆到全抗体表达载体pAC-L-Fc上。转染昆虫sf-9细胞，利用杆状病毒，昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达，免疫沉淀试验鉴定它的抗蛋白。结果 分离到一株Fab克隆AAVs-31，腺病毒伴随病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性，间接免疫荧光试验呈阳性，序列分析结果表明是一新的序列，所获得的基因为人源IgG Fab基因。由Gamma链和Kappa链组成。表达的全抗体ELISA反应、免疫荧光反应和间接免疫荧光试验均为阳性，免疫沉淀试验结果显示它结合病毒颗粒，不结合任一VP1、VP2、VP3单独衣鞘蛋白。结论 用噬菌体表面表达技术首次获得了抗腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段，并在真核系统中表达了其全抗体，它们识别的可能是衣鞘蛋白组装时形成的表位。     

139名跨境工作人员淋巴脉络丛脑膜炎病毒和汉坦病毒感染调查分析

目的调查跨境务工人员经鼠传播淋巴脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV )和汉坦病毒(hantavirus, HV)的感染状况, 初步评估鼠传病毒感染风险。方法本研究于2019—2020年间, 针对常年在境外从事户外工程工作的务工人员开展调查, 采集血清样本, 通过基于LCMV重组核蛋白的间接ELISA方法、免疫印迹法和基于LCMV重组糖蛋白的间接免疫荧光法检测样品血清中LCMV特异性IgG抗体, 采用检测汉坦病毒IgG抗体的商业化ELISA试剂盒和汉坦病毒感染抗原片检测血清中HV IgG抗体情况。结果共调查了139名跨境工作者, 年龄在25～57岁之间, 64%(89/139)有多个国家工作经历, 涉及26个国家, 包括14个亚洲国家和12个非洲国家, LCMV IgG抗体检出率11.51%(16/139), 阳性样本经免疫印迹法和间接免疫荧光法核实, 抗体检出率略高于类似调查中发现的人群感染率;HV抗体检出率0.72%(1/139), 但尚不能确定获得感染的时间和地区。结论本研究揭示了境外务工人员中LCMV和HV病毒感染状...     

发热伴血小板减少综合征病毒在巨噬细胞中的亚细胞定位

目的 发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)是新发传染病发热伴血小板减少综合征的致病病原,为布尼亚病毒科白蛉病毒属一种新型病毒.通过研究发热伴血小板减少综合征病毒在巨噬细胞中的亚细胞定位,了解SFTSV在细胞内的复制组装机制.方法 应用两种人源巨噬细胞系THP-1细胞和U937细胞,通过免疫荧光共聚焦方法分析SFTSV感染巨噬细胞后与高尔基体和内质网的共定位.结果 SFTSV可特异性感染巨噬细胞,在SFTSV感染的巨噬细胞中SFTSV核蛋白与高尔基体共定位于核周,与内质网紧密相邻,但没有共定位.结论 在SFTSV感染的巨噬细胞中,内质网和高尔基体可能是病毒进行加工修饰及包装成熟的重要场所.     

登革3型病毒义乌流行株免疫原性研究

目的对2009年浙江省义乌市暴发流行的登革3型病毒进行系统进化分析并初步研究其E蛋白的免疫原性。方法 RT-PCR扩增义乌分离株全基因组,利用MEGA 4分别构建E及NS1区域核苷酸及氨基酸系统发生树,进行系统进化分析。构建重组质粒JESS-ywD3prM/E397JEV-pcDNA5,IFA及Western Blot检测E蛋白在293T细胞中的表达及分泌情况。将纯化后的分泌性E蛋白免疫BALB/c小鼠,通过ELISA、中和试验等方法对体液免疫进行测定。结果登革3型病毒义乌分离株与广州GZ1D3株及印度GWL-25株核苷酸及氨基酸序列同源性均达到99%以上;其分泌性E蛋白可以刺激小鼠产生登革特异性IgG抗体及针对同型病毒的中和抗体。结论义乌分离株属于登革3型病毒亚型Ⅲ,其分泌性E蛋白具有一定的免疫原性。     

具有G-CSF抗原结合活性的三个重组噬菌体单链抗体基因的筛选及序列测定

利用固相化GCSF亲和吸附法,从已构建的抗rhGCSF全套单链抗体(ScFv)噬菌体表面展示文库中,筛选出含有特异抗体片段的噬菌体颗粒。结合直接感染法和酸性洗脱液洗脱法,进行4轮亲和富集筛选,并通过ELISA法结合双酶切鉴定,共筛选出9个具有GCSF结合活性的完整的重组噬菌粒克隆。对其中3个阳性克隆进行了ScFv基因全序列测定,获得6个抗体可变区基因的全序列。计算机分析表明,它们均为新发现的小鼠免疫球蛋白可变区基因。     

登革2型病毒ZS01/01株E蛋白在真核细胞中的分泌表达研究

目的 对登革2型病毒(DENV-2)ZS01/01株E蛋白在哺乳动物细胞及昆虫细胞中的分泌表达进行研究.方法 RT-PCR扩增DENV-2 prM/E基因,通过融合PCR在prM基因前添加来自乙型脑炎病毒的信号肽序列,并将E基因羧基末端20%区域缺失或替换为乙型脑炎病毒SA14-14-2株E基因相应序列,将上述基因元件分别克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA5/FRT及昆虫细胞表达载体pAcUW51-M中,将重组质粒转染293T细胞或S19细胞,利用间接免疫荧光(Immunofluoreseence assay,IFA)及Western Blot检测E蛋白的表达与分泌.结果 各重组质粒分别转染293T细胞或Sf9细胞后,E蛋白在细胞内均有效表达,而仅有携带乙脑信号肽且缺失或替换E基因羧基末端20%区域的重组质粒转染293T细胞后,上清中可检测到明显的E蛋白分泌.结论 信号肽及E基因羧基末端20%区域对登革病毒E蛋白的分泌至关重要,宿主细胞对其亦有一定影响.     

抗狂犬被动免疫制剂研究进展

狂犬病是由狂犬病毒(rabies virus,RV)引起的人畜共患疾病,一旦感染,如不及时采取有效防治措施,其病死率接近100％.狂犬病的暴露后预防(post-exposure prophylaxis,PEP)是防治狂犬病的主要措施.为获得快速的保护作用,世界卫生组织建议,对于严重暴露者应同时使用注射狂犬疫苗和狂犬病毒免疫球蛋白(rabies immune globulin,RIG)进行主动和被动免疫治疗[l].     

Expression and function analysis of dengue virus type 1 to 4 envelope domain Ⅲ recombinant fusion protein

Objecfive To observe the ability of dengue virus type 1-4 envelope domain Ⅲ fusion protein to inhibit virus infection and analyze the neutralizing ability of polyclonal antibodies against rEⅢ.Methods After being connected by linker peptide.EⅢ protein of Dengue virus serotypes 1-4 were expressed in E coli BL21(DE3) then purified.Fusion proteins were verified by Western Blot and ELISA.Rabbits were immunized with fusion proteins to produce anti-rE Ⅲ serum.The activity of anti-rEⅢ serum were detected through indirect immunofluorescence assay test.Inhibition of dengue virus type 1 to 4 infection in BHK-21 cells by rEⅢ fusion protein were tested.Neutralizing activity of anti-rEⅢ serum was analyzed.Results Dengue virus type 1 to 4 envelope domain Ⅲ recombinant fusion protein was expressed in Ecoli BL21 and purified successfully.Then rEⅢ fusion protein and anti-rEⅢ serum were analyzed respectively and rEⅢ fusion protein can effectively inhibit dengue virus type 1 to 4 from infecting BHK cells.The anti-rE Ⅲ serums can neutralize dengue virus type 1 to 4 but with different neutralizing titer.Conclusion Dengue virus type 1-4 envelope domain Ⅲ fusion protein can directly inhibit DV infeetion.Antibodies induced by rE Ⅲ fusion proteins can neutralize dengue virus type 1-4.