弓形虫 SAG1基因的表达及其诱导的细胞免疫应答

目的分析弓形虫 SAG1基因真核表达质粒的体外表达及其诱导小鼠的细胞免疫应答.方法重组表达质粒 pVAX1-SAG1瞬时转染 vero细胞, Western blot法检测在细胞中的表达.将重组真核表达质粒 pVAX1-SAG1及空质粒 pVAX1于 0、 4周分别经肌注免疫 BALB/c小鼠;第 8周杀鼠,取脾,分离淋巴细胞,分别经 ConA和抗原刺激,用 MTT法测定免疫鼠脾脏 T淋巴细胞转化率 ;使用直接免疫荧光法 ,用流式细胞仪对 CD4+、 CD8+ T细胞亚群进行测定;两组小鼠经弓形虫速殖子攻击感染,计算存活期.结果 Western blot法分析转染细胞,发现存在弓形虫感染血清识别的 26 000u的特异带,与理论值相符 ;抗原刺激小鼠脾 T淋巴细胞发生增殖反应 , 免疫组与空质粒对照组间差异有显著性 (P< 0.05),但 ConA刺激小鼠后,两组间差异无显著性 (P >0.05); T细胞亚群 CD4+、 CD8+动态分析 ,CD4+、 CD8+ T细胞数量均升高,免疫组与空质粒对照组差异均有显著性 (P1< 0.05, P2< 0.05).弓形虫攻击感染,免疫组鼠的平均存活时间较空质粒对照组延长.结论 真核表达质粒 pVAX1-SAG1在 vero细胞中获得表达 ,且能诱导 BALB/c小鼠产生细胞免疫应答.     

弓形虫表面抗原SAG1 DNA疫苗的构建

目的　构建真核重组表达质粒 pVAX1-SAG1,并探讨其诱导的体液免疫应答。 方法　采用多聚酶链反应技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增截短型的SAG1基因片断 ,并克隆至载体pMD18-T ,经菌落PCR鉴定和测序分析后 ,亚克隆至真核表达载体 pVAX1,构建重组真核表达质粒pVAX1-SAG1,并予菌落PCR和双酶切鉴定。以此为疫苗候选分子免疫小鼠 ,检测其诱导产生的抗体。结果　PCR扩增出SAG1基因的截短型片段 ,其大小约 780bp ;测序的阳性TA克隆除两处发生同义突变外 ,其余序列与原序列一致 ;TA克隆的插入片段被亚克隆到真核表达载体 pVAX1,构建了重组表达质粒pVAX1-SAG1;该质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。 结论　成功构建了弓形虫表面抗原SAG1的DNA疫苗。