2型糖尿病动物模型KK-Ay小鼠糖尿病肾病的鉴定

目的 研究2型糖尿病KK-Ay小鼠糖尿病肾病(DN)的特点和应用价值.方法 选择雄性KK-Ay小鼠和C57BL/6J小鼠各30只,每两周代谢笼收集24 h尿液及随意尿测尿微量白蛋白,眶后静脉丛采血测空腹血胰岛素、糖化血红蛋白、血糖、胆固醇、甘油三酯、尿素氮、肌酐、白蛋白.8、12、20周龄时两组分别处死10只小鼠取肾脏行病理检查.结果 不同周龄KK-Ar小鼠尿微量白蛋白、血胰岛素、糖化血红蛋白、血糖、胆固醇、甘油三酯均比同周龄C57BL/6J小鼠高(P＜O.05),且随周龄增加而进展,8周龄表现为典型2型糖尿病,12周龄进入早期DN,20周龄肾脏病理表现为特征性DN改变,但未见肾功能下降.结论 KK-Ay小鼠是研究DN早期病变的理想模型.     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ在Han:SPRD大鼠肾脏中的表达分布及其意义

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)在HanSPRD大鼠不同表现型中的表达分布,探讨PPAR-γ途径在常染色体显性多囊肾病(ADPKD)发病中的作用及机制.方法采用免疫组化方法研究PPAR-γ的表达分布,RT-PCR方法检测各表现型中不同性别不同时期肾脏皮质组织PPAR-γ及TGF-β1、MCP-1的mRNA表达情况,组织学分析并量化囊肿指数(cyst index)、纤维化评分(fibrosis score)及间质炎细胞浸润程度.结果HanSPRD纯合子及杂合子大鼠PPAR-γ在肾皮质近端小管及囊肿上皮细胞中表达明显增高,在近端小管上皮细胞中主要分布于胞浆,而在囊肿上皮细胞则易位于核周及细胞核.纯合子(Cy/Cy)及杂合子(Cy/+)较正常大鼠(+/+)PPAR-γ及TGF-β1、MCP-1mRNA表达上调,同时雄性杂合子表达水平高于同周龄雌性杂合子(P＜0.05).雄性杂合子组织学指标囊肿指数、肾脏纤维化评分及间质炎细胞浸润程度高于雌性杂合子(P＜0.05).结论 PPAR-γ在该模型中表达上调与TGF-β1、MCP-1表达水平及肾脏组织学改变显著相关,PPAR-γ激活可能对于ADPKD病程进展有一定保护作用.     

大鼠自体内瘘模型制备及内瘘狭窄的实验研究

目的吻合口内膜增生可导致自体动静脉内瘘失功,本研究拟在设计大鼠模型研究其进程及机制。方法SPF级wistar大鼠,行右颈总动脉-颈内静脉端端吻合,术后14,28天处死,取近吻合口静脉、动脉组织,行HE染色,弹力、胶原纤维的双重组合染色,PCNA、TGF—β1、NF—kB免疫组化。结果内瘘吻合术后14天近吻合口静脉端见明显的内膜增生,呈息肉样增生,其中平滑肌细胞增生活跃,大量胶原纤维沉积,28天管腔明显狭窄。特殊染色见术后14、28天近吻合口静脉内弹力层不连续。PCNA、NF—kB在近吻合口静脉壁中膜和外膜高表达,在14天达到一个高峰,在28天观察期内仍持续高表达。TGF—β1在外膜基质高表达。结论大鼠右侧颈总动脉-颈内静脉端端吻合可模拟内瘘局部血流动力学的影响,短期内可见明显内膜增生等病理表现,是一种合适的自体动静脉内瘘动物模型,显示TGF-β1,NF—kB参与了内瘘内膜增生病理过程。     

早期应用低蛋白加α酮酸饮食对延缓KK—Ay小鼠糖尿病肾病进展的作用

目的：观察早期应用低蛋白加α酮酸饮食对2型糖尿病肾病动物模型KK—Ay小鼠肾脏病变的影响,并探讨其作用机制。方法：雄性KK—Ay小鼠30只,12周龄开始给予不同饮食干预,分为正常蛋白组（22％酪蛋白,NPD组）15只和低蛋白加α酮酸组（5％酪蛋白＋1％a酮酸,Keto组）15只;另设性别周龄相同的C57／BL6J小鼠15只为对照（CON组）,始终给予正常蛋白饮食。检测第8、14、20周龄各组小鼠尿白蛋白,血清中葡萄糖、胰岛素、糖化血红蛋白、胆固醇、三酰甘油、尿素氮、肌酐、白蛋白等生化变化。对20周龄小鼠肾组织病理进行图文分析和半定量检测,免疫组化方法测定肾组织中TGF—β．FN表达量。结果：Keto组小鼠14周龄时血糖、ACR（白蛋白／肌酐）、尿白蛋白排泄率、三酰甘油低于NPD组（P〈0．05）,20周龄时糖化血红蛋白、血胰岛素、肾小球面积及系膜区面积显著降低（P〈0．05）。免疫组化结果显示NPD组小鼠肾内TGF—β蛋白表达及肾小球FN沉积明显增多（P〈0．05）。结论：早期应用低蛋白加α酮酸饮食能够显著降低KK—Ay小鼠尿白蛋白,减轻系膜基质增生和结节性硬化,而不引起营养不良,并可能通过减少TGF-β表达抑制FN等系膜基质增加而延缓糖尿病肾病的进展。     

常染色体显性多囊肾病患者体液富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白浓及其在肾组织中的表达

目的研究富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(SPARC)在常染色体显性多囊肾病(ADPKD)患者体液中的浓度及在肾组织中的分布和表达.方法采用ELISA法测定ADPKD患者血浆、尿液和囊肿液以及正常人血浆和尿液中的SPARC浓度.原位杂交、免疫组化、实时荧光定量RT-PCR和Western印迹方法检测SPARC mRNA和蛋白在多囊肾组织和正常肾组织中的分布和表达水平.结果 ADPKD患者囊液中SPARC浓度为(3628.75±1445.90)ng/ml,显著高于血浆和尿液中的SPARC浓度(P＜0.01,P＜0.01);ADPKD组尿液中的SPARC含量比对照组明显升高[(1253.16±544.81)比(123.91±28.37)ng/ml,P＜0.01],而两组血浆中SPARC浓度无明显差异.在成人ADPKD肾组织中,SPARC主要表达于囊肿衬里上皮细胞及扩张的小管和集合系统,ADPKD肾组织中SPARC mRNA水平[(3.61±0.24)×102拷贝/106GAPDH]显著高于正常肾组织[(1.72±0.09)×102拷贝/10 6 GAPDH](P＜0.01).正常肾组织和多囊肾组织中的SPARC蛋白吸光度与相应的GAPDH吸光度比值分别为44.68%和81.25%.结论 ADPKD患者囊液和尿液中增多的SPARC可能来自囊肿衬里上皮细胞及扩张的小管和集合系统.     

常染色体显性多囊肾病患者与正常成人尿液的定量比较蛋白质组学分析

目的搜索常染色体显性多囊肾病(ADPKD)患者与正常成人尿液蛋白质组中有丰度差异的蛋白质成分。方法制备ADPKD患者(PKD1突变)及正常成人尿液蛋白组样品，同位素编码的亲和力标签法标记蛋白质、筛选被标记肽段，二维液相色谱一串联质谱法分离鉴定被标记肽段，从而鉴定蛋白质。通过计算两同位素试剂标记的相同肽段指纹峰面积比，寻找有丰度差异的蛋白质。根据被鉴定肽段的可信度，从鉴定出的蛋白质中选出6种，免疫印迹法验证其在两尿液蛋白组样品中的丰度差异。结果两尿液蛋白质组共鉴定出尿蛋白质106种，ADPKD患者尿液中水平较正常上调者48种，下调者45种。其中多囊蛋白1、肝细胞生长因子、单核细胞趋化蛋白3及孕激素受体等5种蛋白丰度差异为免疫印迹所证实。结论包括多囊蛋白1在内的多种蛋白质成分在ADPKD患者尿液中丰度发生改变，差异蛋白包括生长因子、凋亡调节蛋白、细胞外基质成分、受体、参与胞浆运输的蛋白质、酶类、细胞信号蛋白、转录因子及转录调节因子等．这些蛋白质信息可能为寻找与ADPKD发病相关的蛋白提供部分实验依据。     

IgA肾病患者尿足细胞排泄与临床病理相关性分析

目的观察原发性IgA肾病患者尿足细胞排泄、肾小球足细胞病变,分析其与临床病理之间的关系。方法50例经肾活检明确诊断的IgA肾病患者和10名健康志愿者,利用podocalyxin（PCX）作为标记蛋白,标记尿液和肾组织足细胞,收集患者肾活检时临床资料,各项病理指标和肾组织足细胞PCX荧光表达采用不同的半定量积分法进行评分,电镜检测肾小球外周袢的足突宽度。结果①IgA肾病患者中尿足细胞染色阳性为32例（64％）,较健康对照者有统计学差异。②IgA肾病伴尿足细胞阳性患者尿蛋白水平、血肌酐（SCr）、平均动脉压（MAP）较尿足细胞阴性患者增高,血浆白蛋白（Alb）、肾小球滤过率（GFR）降低（P〈0．05）。③光镜示IgA肾病伴尿足细胞阳性患者肾小球硬化程度、新月体发生率较尿足细胞阴性患者明显增高（P〈0．05）,但小管间质病变与肾组织足细胞PCX表达阳性指数,2组比较无统计学差异。④电镜结果提示IgA肾病患者尿足细胞阳性足突宽度明显增宽（P〈0．05）。结论足细胞尿是反映肾脏疾病轻重的一个指标,足细胞尿与肾脏病理类型有一定关系,IgA肾病患者尿足细胞排泄指标是否能够独立预测患者的预后还有待证实。     

表皮生长因子及其受体在多囊肾病大鼠体液及肾组织中的表达及意义

目的:观察常染色体显性多囊肾病大鼠体液及肾脏组织中表皮生长因子(EGF)及其受体(EGFR)的表达,探讨二者在多囊肾病发病过程中的作用。方法:采用ELISA方法检测多囊肾病Han:SPRD大鼠血液、尿液中EGF含量,蛋白质印迹法、原位杂交及免疫组织化学方法观察EGF/EGFR在大鼠肾组织的表达。结果:大鼠尿液中EGF含量远高于血液,3周龄大鼠体液EGF含量高于3个月龄,杂合患病大鼠尿液中EGF浓度(pg/ml)显著低于正常大鼠(263.45±48.53 vs 321.09±74.57,P<0.05)。患病大鼠肾组织EGF表达位置不变,但表达量显著低于正常;EGFR异位表达在囊肿细胞基底膜面和腔膜面,且表达强于正常大鼠;EGFR与磷酸化EGFR表达量从高至低依次为cy/cy大鼠、cy/+大鼠和+/+大鼠。结论:多囊肾病大鼠发病过程中存在EGF/EGFR信号转导通路的异常激活。     

血清代谢组学技术在2型糖尿病肾病早期诊断中的应用

目的探讨基于液质联用（LC／MS）的代谢组学技术在2型糖尿病肾病动物模型KK—Ay小鼠不同病程的诊断应用价值。方法试验组KK-Ay小鼠和对照组C57BL／6J小鼠各15只,从8周龄开始,每4周收集24h尿液测尿微量白蛋白,乙醚麻醉后空腹采血,分离血清检测空腹血糖、甘油三酯、尿素氮、肌酐、白蛋白等,同时对血清样品预处理进行LC／MS检测及代谢组学分析。第8、12、20周龄两组各处死3只小鼠,灌洗取肾后进行病理学检查。结果12周龄后KK—Ay小鼠空腹血糖、甘油三酯、尿微量白蛋白与C57BL／6J小鼠有统计学差异（P〈0．01）。KK—Ay小鼠12周龄系膜基质增加明显,20周龄出现基底膜增厚等病理改变。代谢组学主成份分析显示,各周龄KK—Ay小鼠与C57BIM6J小鼠血清代谢图谱差异显著,早于血生化和肾脏病理变化,代谢物模式的经时变化轨迹图能够反映2型糖尿病肾病的进展规律。结论基于LC／MS的代谢组学技术对动物血清的检测分析能准确区分各周龄试验组和对照组小鼠,并揭示病程进展规律,其作为一种辅助手段,可能在2型糖尿病肾病的早期诊断中具有应用前景。     

狼疮性肾炎患儿外周血CD4+CD25+调节性T细胞的变化

目的 探讨狼疮性肾炎(LN)患儿外周血CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)的变化及意义.方法 采用流式细胞术检测30例LN患JL(LN组)和30例健康儿童(对照组)外周血CD4+CD25+调节性T细胞百分比,并分析其与24-h尿微量白蛋白(UMA)及狼疮活动指数(SLE-DAI)的关系.结果 LN患儿外周血中CD4+CD25+Tregs明显低于对照组(P<0.01);CD4+CD25+Tregs 与24-h UMA呈显著负相关,与SLE-DAI呈等级负相关.结论 LN患儿外周血CD4+CD25+Tregs百分比异常降低可能参与LN的起病与发展.CD4+CD25+Tregs百分比与24-h UMA呈显著负相关,与SLE-DAI呈等级负相关,提示可以作为监测LN患儿病情及预后的指标.