通用引物检测志贺毒素和紧密素多个基因亚型

目的旨在建立同时检测stx2和intimin两个基因多个变型的双重PCR快速检测技术,更好满足实验室和临床检测的需求。方法以stx2主要的6个亚型和intimin主要的27个基因亚型为靶序列,设计引物,建立双重PCR方法,分析其敏感性、特异性,并检测模拟制备的阳性样品。结果stx2-intimin双重PCR扩增片段分别为388bp和609bp,检测大肠杆菌纯培养物最低限介于10～100cFu／mL,增菌样品最低检测限介于1～10CFU／g,特异性检测intimin和stx2的多个亚型。结论Stx2-Intimin二重PCR技术灵敏、特异、通用和高效。     

检测猪链球菌2型胞外因子（EF）的PCR方法的建立

根据猪链球菌2型的ef基因和ef^*基因合成了一对可扩增长度为626bp目的片段的引物,成功地建立了检测胞外因子（EF）的PCR方法。用HaeⅡ内切酶进行酶切,获得了与预期一致的354bp和272bp的两个片段,并进行了PCR的牧民性试验和敏感性试验。对马腺疫链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌和猪肺炎霉形体的PCR检测结果均呈阴性;检测的敏感度可达100个细菌。另外,对9株猪链球菌2型菌株进行了检测,7株呈EF阳性,1株呈EF^*阳性,1株呈EF阴性;对15份正常屠宰猪扁桃体分离物的检测结果1份为阳性。实验结果表明此法特异性和敏感性很高,可作为EF快速诊断和流行病学调查的手段。     

猪链球菌2型的分子流行病学研究

目的　了解猪链球菌 2型高发地区 (疫区 )与少发地区 (非疫区 )猪群的带菌率及其毒力因子MRP与EF的分布情况 ,探讨猪链球菌 2型的发生及其流行规律。方法　分别从不同地区采集正常屠宰猪或活体采集成年猪扁桃体 ,经接种马丁汤培养基增菌培养后 ,用PCR方法进行 2型猪链球菌的检测 ,同时检测各 2型菌的主要毒力因子溶菌酶释放蛋白 (MRP)与细胞外蛋白因子 (EF)基因 (mrp和epf)。 结果　除少数猪群外正常猪群中猪链球菌 2型的带菌率普遍较高 ,为 31 6 %～77% ,平均为 4 0 9% ,且疫区 (39% )与非疫区 (42 % )差异不明显。但毒力因子mrp和epf的阳性率疫区与非疫区存在明显差异 ,非疫区的 2型菌株除极少数表现为mrp+ epf-(5 % )或mrp-epf+ (5 % )外 ,绝大多数 (90 % )都表现为对猪无毒力的mrp-epf-表现型 ,无一株表现为mrp+ epf+ ;来自疫区的所有 16株 2型菌株均为对猪有强毒力的mrp+ epf+ 表现型。结论　正常猪群中 2型猪链球菌的带菌率与猪群是否暴发流行该病可能并无直接关系 ,但疫区猪群mrp+ epf+ 表现型菌株检出比率较高 ,提示携带mrp+ epf+ 表现型菌株的猪可能是本病的主要潜在传染源     

乙型脑炎病毒E基因在杆状病毒中的表达及其初步应用

目的克隆表达日本乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV)的E基因,研究其抗原性,并初步作为诊断抗原建立JEV抗体检测方法。方法用RT-PCR方法扩增E基因全长,然后克隆到pFastbacTM载体中,转化宿主菌DH5a中,提取阳性克隆质粒转导到DH10Bac,利用通用引物鉴定阳性,提取其基因组转染昆虫细胞sf9,而后经IFA和Western blot进行鉴定。挑蚀斑纯化获得高纯度和高滴度的重组病毒,收集细胞裂解上清作为抗原建立间接ELISA方法,对不同年龄段猪血清进行检测。结果从JEV中成功克隆E基因,并在昆虫细胞中得到表达,分子量约53kD,具有良好的抗原性。建立的ELISA方法的抗原最佳包被浓度为30μg/ml,待检血清的最佳稀释度为1:40,阳性判定标准初步定为OD450≥0.3,且OD值待检血清/OD值阴性血清≥2。结论JEV的E基因经过体外昆虫细胞表达,获得抗原性良好的蛋白作为诊断抗原,用其建立的ELISA方法能很好用于猪群JEV抗体水平的检测。     

猪链球菌9型分离株的耐药性及耐药基因分析

目的 了解猪链球菌9型(Streptococcus suis serotype 9,SS9)的耐药性和耐药基因情况。方法 采用药敏纸片扩散法检测15株SS9菌株对9类21种不同抗生素的耐药性,并通过PCR方法检测其大环内酯类及四环素类耐药基因的携带情况。结果 被检菌株对大环内酯类及林可胺类耐药率都为100%,对四环素及链霉素的耐药率都为93.3%,对头孢类、氯霉素类、阿莫西林、糖肽类以及庆大霉素较为敏感。所有菌株均耐7种及以上抗菌药物,最高可耐16种,其中以8重耐药的菌株数量最多。不同地区SS9分离株对抗生素耐药情况不同,健康猪分离株耐药情况较病猪分离株更为严重。100%的菌株具有ermB基因,93.33%的菌株具有tetO基因,表明ermB和tetO分别可能是介导SS9对大环内酯类及四环素产生耐药性的主要原因之一。结论 本研究为猪链球菌9型的预防和临床治疗、耐药性及耐药机制的研究提供了参考依据。     

High Five昆虫细胞系的致瘤性研究

目的 检测High Five昆虫细胞系对BALB/c裸鼠致瘤性情况,以确保其作为疫苗生产细胞株的安全性。 方法 将裸鼠随机分为 5 组,分别为High Five基础细胞库细胞试验组、High Five最高限制代次细胞试验组、HEp-2细胞阳性对照组、CEF细胞阴性对照组和不作任何处理的空白对照组,用细胞悬液背部皮下接种裸鼠。3周和12周后对裸鼠解剖及病理组织学检查,其是否有肿瘤形成。结果 阳性对照HEp-2细胞组裸鼠接种后3周注射部位形成结节,病理组织学检查为鳞状细胞癌;阴性对照CEF细胞组和High Five细胞组均无结节形成,接种后12周经解剖用病理组织学检查,均无肿瘤形成。结论 基础代次和最高限制代次High Five细胞均不具有致瘤性,可安全地应用于疫苗生产。     

从正常屠宰猪扁桃体中分离到致病性猪链球菌2型

目的从江苏省某屠宰场采集的40份屠宰猪的扁桃体中分离到一株细菌,通过玻片凝集试验、培养特性、菌体形态、菌落形态、染色特性、生化试验、PCR检测试验,确定为猪链球菌2型,编码为HA0610。进一步研究发现,该菌株含有已知的8种主要毒力因子基因,动物试验显示对猪和兔均有较强的致病性。结果表明,在正常猪扁桃体中可携带对猪有高度致病性的猪链球菌2型。