原癌基因BMI-1的研究进展

BMI-1(B-cell specific moloneyleukemia virusinsertion site 1,BMI-1)是PcG(Polycomb group,PcG)家族的一员,同时也是一种原癌基因,与c-myc一起参与小鼠T、B细胞淋巴瘤的发生。选择性敲除BMI-1可导致出生后进行性发育迟缓、神经系统异常和严重的造血缺陷等。本文就原癌基因BMI-1的研究进展作一综述。1 PcG家族的概述PcG基因家族最初是在果蝇体内作为HOX的抑制因子被鉴定出,迄今为止已发现30~40种PcG基因,它们协同作用以维持机体内细胞的转录抑制状态。PcG家族调节许多生命过程中的基因表达,包括造血、前后轴形成以及调控靶基…     

不同新型冠状病毒核酸检测试剂的临床性能评价

目的 评价同一厂家新型冠状病毒(2019?nCoV)核酸检测扩增时间长的试剂(试剂A)与扩增时间短的试剂(试剂B)的临床性能,分析试剂更换的可行性.方法 用2019?nCoV阴性混合样本将商品化2019?nCoV RNA液体室内质控品(以ORF1ab浓度赋值17300 copies/mL)梯度稀释成1730、865、5...     

pEGFP-BMI-1真核表达载体的构建、鉴定及其表达

本研究构建真核表达载体pEGFP-BMI-1并观察其在HeLa细胞中的表达。将BMI-1逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)产物克隆入pEGFP-N1,经酶切、PCR鉴定及测序分析,构建pEGFP-BMI-1真核表达载体;采用脂质体转染法,将融合基因pEGFP-BMI-1转入HeLa细胞,用荧光显微镜和Western blot检测其表达,SYBR Green I实时定量RT-PCR方法检测转染前后HeLa细胞中P16INK4a mRNA的表达变化。结果表明:重组后的pEGFP-N1质粒已成功载入BMI-1的全长编码基因,序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜下可见在转染pEGFP-BMI-1的HeLa细胞中存在荧光分布;Western blot检测发现存在外源性融合蛋白BMI-1-EGFP的表达。在HeLa细胞中过表达BMI-1显著下调P16INK4a mRNA的表达为对照组的9.2%(P<0.01)。结论:成功构建了真核表达质粒pEGFPBMI-1,转染HeLa细胞后可表达融合蛋白BMI-1-EGFP。这为今后研究BMI-1在肿瘤发生发展中的机制奠定了基础。     

不同实时荧光定量PCR仪对外周血中EB病毒DNA检测结果的影响

目的:应用同一种商品化EB病毒核酸定量检测试剂盒在2款实时荧光定量PCR仪同时检测外周血标本中EB病毒载量,探讨不同类型的实时荧光PCR仪对EBV DNA定性和定量检测结果的影响.方法:提取179例外周血标本(包括102例全血和77例血浆)的DNA后,应用EB病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)分别在2款实时荧...     

湖北汉族人群T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白-3基因单体型与变应性支气管哮喘的相关性

目的 分析湖北汉族人群T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3)启动子区-1516G/T和外显子3区4259G/T单核苷酸多态性及其连锁不平衡关系,探讨其构成的单体型与支气管哮喘(简称哮喘)易感性之间的关系.方法 2004年6月至2007年10月采用等位基因特异性聚合酶链反应检测湖北汉族175例哮喘患者(哮喘组)和202名健康者(健康对照组)TIM-3-1516G/T和4259G/T的单核苷酸多态性,计算基因型和等位基因频率、两位点间的连锁不平衡系数(D')值及单体型频率.结果 TIM-3基因-1516G/T基因型GG、GT和TT在健康对照组中分布频率分别为82.7%(167/202)、17.3%(35/202)、0(0/202),哮喘组分布频率分别为82.9%(145/175)、17.1%(30/175)、0(0/175);TIM-3基因4259G/T基因型GG、GT和,TT在健康对照组中分布频率分别为0.5%(1/202)、2.5%(5/202)、97.0%(196/202),哮喘组分布频率分别为0.6%(1/175)、5.7%(10/175)、93.7%(164/175).对照组D'值为1.0,哮喘组D'值为0.9.湖北汉族人群中存在3种单体型(G-G、G-T、T-T),这3种单体型频率在健康对照组分别为1.7%(7/404)、89.6%(362/404)、8.7%(35/404),哮喘组分别为3.4%(12/350)、88.0%(308/350)、8.6%(30/350);3种单体型(G-G、G-T、T-T)与哮喘易感性无相关性(x2值分别为2.15、0.47、0.003,P均＞0.05).结论 TIM-3基因-1516G/T与4259G/T之间存在紧密连锁不平衡关系,G-G、G-T、T-T与哮喘易感性无相关性.但不排除是否与其他种族人群中哮喘易感性相关或与其他过敏性疾病和自身免疫性疾病的易感性相关.     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测BMI-1 mRNA方法的建立

目的 建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人类BMI-1 mRNA的方法.方法 以含有目的基因BMI-1 cDNA的质粒pEGFP-BMI-1为阳性模板,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测BMI-1,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果 该法检测的线性范围为6.4×101～6.4×107拷贝,相关系数r为-1.00,6.4×103拷贝/反应的标本批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.6%和2.8%.熔解曲线分析显示单一的峰,Tm为(80.40±0.18)℃.结论 SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测BMI-1 mRNA是快速有效、灵敏度高、特异性好的方法,可为BMI-Ⅰ的进一步研究奠定基础.     

人T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3基因及其融合蛋白真核表达载体的构建和生物信息学分析

目的：构建T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3基因及其融合蛋白真核表达载体,并对TIM-3基因进行生物信息学分析。方法：采用Trizol法从人外周血单个核细胞提取总mRNA,利用两步法RT-PCR技术扩增TIM-3及其胞外（结构）域基因片段和人IgG1Fc基因片段。并将他们分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,通过PCR及测序进行鉴定。序列分析后将TIM-3胞外（结构）域基因片段亚克隆到已经克隆了人IgG1Fc基因片段真核表达载体pcDAN3.1（＋）上;并通过PCR及双酶切进行鉴定。应用生物信息学初步分析TIM-3基因的物理化学性质、蛋白质结构域、功能。结果：成功从PBMC中提取并逆转录的cDNA扩增出TIM-3及其胞外（结构）域基因和人IgG1Fc基因;经PCR、酶切鉴定、测序分析表明它们与GenBank提供的序列信息完全相同。生物信息学分析结果表明TIM-3蛋白为稳定亲水性蛋白,有1个跨膜螺旋结构,相对分子量是33.4KD,等电点pI为5.54。该蛋白含约32.56%的α-螺旋,8.27%的延伸链,49.17%的不规则卷曲,1段21个氨基酸组成的信号肽。TIM-3蛋白亚细胞定位于内质网、高尔基体、液泡、细胞膜上。功能分析预测TIM-3蛋白具有受体和信号转导功能。结论：成功构建TIM-3基因及其融合蛋白真核表达载体,并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解TIM-3基因的性质特征,为进一步研究该基因奠定基础。     

两款荧光定量PCR仪检测HLA-B27基因结果比对分析

目的:探讨试剂与仪器匹配因素对PCR荧光法检测HLA-B27等位基因的影响。方法:首先采用自建荧光定量PCR法对85例样本中HLA-B27等位基因进行检测,随后采用商品化试剂盒PCR荧光法同时在两款荧光定量PCR仪Stratagene Mx3000P~?和Roche cobas~? Z480上对HLA-B27进行再次检测。结果:商品化试剂盒方法在cobas~? Z480上检出HLA-B27等位基因的结果为65例阳性、20例阴性,与自建方法所检出的结果完全一致;而其在Mx3000P~?上检出的结果为30例阳性、55例阴性,与自建方法的检测结果之间存在显著性差异(χ~2=33.03,P0.005)。该商品化试剂盒方法在Mx3000P~?上的漏检率为53.85%。结论:该商品化试剂与Mx3000P~?荧光PCR仪的匹配性不佳,严重影响了检测结果的准确性。在临床实际工作中,评价PCR试剂的检测性能需要结合仪器,综合考虑以保证检测结果的准确性。     

小鼠Tim-2基因在L929细胞表达后促进铁蛋白的内吞

目的获取BALB／c小鼠T细胞免疫球蛋白域．黏蛋白域蛋白-2（T cell immunoglobulin and mucin domain containing molecules-2，Tim-2）基因，构建真核表达载体在L929细胞中表达并研究其功能。方法RT-PCR获取BALB／c小鼠Tim-2基因，T-A克隆后经测序鉴定后酶切，插入pEGFP-N1真核表达载体，脂质体转染L929细胞，荧光显微镜观察外源基因的表达，然后加入铁蛋白与转染细胞作用。结果外源基因在L929细胞中得到高效表达，荧光显微镜的结果显示，外源基因定位于细胞膜上，并能促进细胞对铁蛋白的内吞。结论Tim-2基因在真核细胞中表达后定位于细胞膜上，并促进细胞对铁蛋白的内吞。