Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定

目的:构建Cdh1小干扰RNA载体,并将其转染至Hela细胞进行鉴定.方法:根据pENTRTM/H1/TO中间载体要求,设计Cdh1小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列,合成相应的DNA单链,退火后连接到pENTRTM/H1/TO线性载体,形成完整载体,进行测序鉴定.分别将测序鉴定成功的Cdh1小干扰RNA载体及对照载体采用脂质体法转染Hela细胞,转染后48 h提取细胞总RNA及细胞总蛋白,采用实时定量PCR和Western Blot检测Cdh1的表达.结果:经测序鉴定成功构建Cdh1小干扰RNA载体和对照载体,分别命名为pENTR/shCdh1和pENTR/shcontrol.与未转染及转染pENTR/shcontrol的Hela细胞相比,转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1表达降低(P《0.05).结论:成功构建Cdh1小干扰RNA载体,并能下调Hela细胞Cdh1的表达.     

不同核因子κB二聚体对永生化神经前体细胞存活的影响

目的 探讨不同核因子κB(NF-κB)二聚体在缺氧缺糖条件下对永生化神经前体细胞(INPC)生存的影响.方法 将含巨细胞病毒启动子的对照载体(RC/CMV)及NF-κB亚基p50、p65的真核表达载体RcCMV-p50、RcCMV-p65分别及共转染INPC.蛋白质印迹法分析不同细胞株p50及p65的表达.凝胶电泳迁移实验(EMSA)检测胞核内NF-κB的DNA结合活性.蛋白质印迹法分析胞质蛋白IκBα的表达.缺氧缺糖13 h后,噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率.结果 转基因后,共得到5株不同细胞,分别命名为INPC、INPC/CMV、INPC/p50、INPC/p65和INPC/p50p65.蛋白质印迹分析显示,p50和p65基因均能在转染相应质粒的细胞株中高效表达.EMSA表明,INPC/p50、INPC/p65和INPC/p50p65细胞胞核中分别形成p50同源二聚体、p65同源二聚体、p50 p65异源二聚体和p50同源二聚体.INPC/p65和INPC/p50p65细胞株中,IκBα在胞质中表达明显升高,并且缺氧缺糖处理13 h后,细胞存活率显著低于其他细胞株(Games-Howell检验,均P＜0.05).结论 p50、p65的高表达可直接导致胞核内不同NF-κB二聚体DNA结合活性的升高.在神经前体细胞中,具有转录活性的NF-κB二聚体减少了缺氧缺糖刺激后细胞的存活,但无转录活性的NF-κB二聚体并未发挥保护性作用.     

APC-Cdh1在中枢神经系统中的表达分布特点

目的：探讨细胞周期末期促进复合物（APC）-Cdh1在中枢神经系统中的表达分布特点.方法：取健康成年雄性SD大鼠脑组织制作冰冻切片,免疫组化染色检测Cdh1的表达部位;免疫荧光双标检测Cdh1表达的细胞定位情况.取出生24h内乳鼠,原代培养神经元及神经干细胞,免疫组化检测NeuN进行神经元鉴定;Nestin染色进行神经干细胞初步鉴定;采用GFAP,MAP2免疫组化染色鉴定NSC分化特性.分别提取神经干细胞与神经元总RNA,采用实时定量PCR检测APC2个调节亚基Cdh1与CDC20的表达.结果：大鼠脑片免疫组化DAB染色显示Cdh1在海马、皮层均有大量表达,免疫荧光双标显示Cdh1表达主要定位于神经元中,星形胶质细胞表达较少.与神经干细胞相比,神经元中Cdh1 mRNA表达升高[（1.00±0.05）vs（2.10±0.07）,P〈0.05],但CDC20 mRNA几乎没有表达（1.00±0.04,0.02±0.01,P〈0.05）.结论：APC-Cdh1在大鼠脑组织中有大量表达,主要定位于神经元,且神经元中Cdh1表达高于神经干细胞.     

运用国际标准建立康复治疗临床实践基地

目的关注和探索如何在本土化条件下引入国际化的康复临床实践教学方式、考核方法和指标等。方法通过多年临床教学中发现的问题,结合国内外研究现状,并对世界物理治疗师联盟(WCPT)的临床教学标准要求做出简析,提出构建国际标准下的康复本土化实践基地的设想,探讨、分享我们在应用中的点滴心得体会和建议。结果解决了临床实践培训基地的定位、培训方式、考核等问题,打破了以往以学科教学为中心的传统教学模式。结论加强技能培训,健全考核体系,形成临床技能多种考核十分重要。     

镜像疗法结合传统康复训练对周围性面瘫的疗效

目的探讨镜像疗法(mirror-therapy,MT)结合传统康复训练对周围性面神经麻痹(peripheral facial paralysis, PFP)患者的治疗效果。方法采用随机、对照研究的方法,利用随机数字生成器对符合纳入标准的40例面神经麻痹患者进行分组,分为MT组(n=20)和传统康复组(n=20)。所有患者均接受面部按摩,呼吸、放松运动,语言交流能力训练等传统康复治疗两月,每周2次,每次约45min。实验组患者在此基础上再增加每周1次MT,遮蔽患侧眼睛,将一面镜子置于正前方,另一面的反光侧朝向健侧,两面镜子成90度贴紧放置。主要训练动作包括吮吸、扬眉及部分情感性表情动作。在治疗前后分别评估复合肌肉动作电位(compound muscle action potential,CMAP)波幅和潜伏期,并运用house-brackmann量表(HBS)、Sunnybrook面神经评定系统(sunnybrook facial grading system,SFGS)及贝克抑郁量表(beck depression inventory scale, BDI)对患者面神经功能状态、抑郁状... 更多     

人胚神经干细胞的长期贴壁培养和鉴定

目的：探讨人胚神经干细胞的长期贴壁培养条件及传代方法.方法：在多种培养条件下,分别从9周和16周人胚脑中分离培养神经干细胞,应用免疫细胞化学的方法对所分离细胞的巢蛋白表达、自我更新能力和多向分化潜能进行鉴定.结果：采用高密度悬浮培养法能有效地从两种胚龄的人胚脑或室管膜下区中分离出神经干细胞,而采用贴壁培养法的人胚神经干细胞能保持干细胞的特性稳定增殖4个月.结论：从大小胚龄的人胚中均可成功分离培养人胚神经干细胞,贴壁培养的人胚神经干细胞能稳定增殖,是进一步进行人胚神经干细胞转基因研究的良好模型.     

人与鼠神经干细胞体外培养特性的比较

目的:比较分析人及鼠神经干细胞体外培养的生长特性。方法:实验于2004-04/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科实验室完成。孕14d及新生Wistar大鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,孕9周及孕16周水囊引产胎儿经胎儿家属同意捐赠,用1×1010L-1或1×108L-1的起始密度分离培养人和鼠神经干细胞。原代培养出现大量悬浮神经干细胞球后,一部分细胞继续悬浮培养,另一部分细胞种入用0.001%多聚鸟氨酸和0.2%明胶包被的培养瓶中贴壁培养。在培养9代左右的人神经干细胞及4代左右的鼠神经干细胞培养液中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷或5%胎牛血清继续培养1周。应用抗巢蛋白及抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷作为人及鼠神经干细胞初步鉴定,应用抗神经胶质酸性蛋白、微管相关蛋白2和2,3-环核苷酸磷酸二脂酶抗体检测其分化,SABC法进行免疫细胞化学染色。结果:①用较高(1×1010L-1)起始密度可有效的分离培养原代人神经干细胞,较低(1×108L-1)的起始密度对鼠神经干细胞分离有利,贴壁培养的人及鼠神经干细胞保持干细胞的特性长期增殖。②人神经干细胞自发聚集能力强、培养维持时间长,相比较而言,鼠神经干细胞单个细胞体积大、分裂增殖快、对起始密度依赖性小、贴壁能力强。③悬浮培养及贴壁培养的人和鼠神经干细胞,经抗巢蛋白及抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷免疫细胞化学染色,均显示阳性。血清诱导分化后,免疫细胞化学染色可显示出微管相关蛋白2、神经胶质酸性蛋白染色阳性的细胞,人与鼠神经干细胞分化后2,3-环核苷酸磷酸二脂酶的染色效果不佳。结论:人神经干细胞和鼠神经干细胞体外培养时生长特性有较大差异。表现为前者需要较高的起始培养密度、聚集能力强、培养维持时间长,后者单个细胞体积大、分裂增殖较快、贴壁能力强。     

电凝法与线栓法制备大脑中动脉缺血模型在脑卒中后中枢痛研究中的应用对比

目的 采用电凝法与线栓法分别造成小鼠大脑中动脉缺血,建立脑卒中后中枢痛(central post-stroke pain, CPSP)模型,探究更贴近临床的造模方法。方法 选择6～8周龄(20～25 g)健康雄性C57BL/6小鼠,随机分为空白对照组(Naive组)、电凝组(dMCAO组)和线栓组(tMCAO组),进行不同造模处理。在造模后行Longa神经功能缺陷评分,利用TTC染色评估大脑梗死体积,通过机械性缩足阈值和热缩足潜伏期评估小鼠的疼痛状态,旷场实验评估小鼠的运动功能。结果 与Naive组相比,电凝组和线栓组小鼠造模后神经功能缺陷评分均升高(均P<0.01),TTC染色可观察到不同程度的脑缺血(P<0.05,P<0.01);与Naive组相比,电凝组和线栓组在造模后的第7、14、21、28天均表现出机械性痛觉超敏和热痛觉过敏,两组差异无统计学意义;与Naive组相比,电凝组小鼠在造模后第29天的运动功能无显著差异,而线栓组小鼠的运动功能下降(P<0.01)。结论 电凝法和线栓法均可诱发脑卒中后中枢痛,但电凝法更贴近CPSP的临床表征,更具复制意义。