凝集素FRIL体外维持造血干/祖细胞长期活存的机制初探

一种新发现的豆类凝集素FRIL(Flt3receptor interact inglectin)可以在离体条件下长期维持造血干 /祖细胞的活存[1] 。FRIL与FL(Flt3ligand)共用一个受体Flt3,在离体条件下 ,通过与FL的对照使用 ,培养 2 8dFRIL具有相对更高的维持造血干 /祖细胞多潜能性的能力。同时检测了FRIL及FL作用过程中几个基因的表达情况 ,并对应它们的功能进行了分析。材料和方法1　材料及试剂盒FRIL由本实验室分离纯化。 35份脐血取自永定路中西医结合医院。磁性细胞分离仪和CD34 细胞分离试剂盒 (miniMACSmagneticcellsortingsystem)购自Miltenyi…     

竹笋提取液复合制剂在失血性贫血中的疗效观察

目的观察竹笋提取液复合制剂治疗失血性贫血的疗效。方法分别采用医用生化分析仪、HP1100色谱仪以及ICTMS检测竹笋提取液中葡萄糖、总蛋白、宏量元素,氨基酸和微量元素的含量。以小鼠内眦静脉丛取血法,建立失血性贫血小鼠动物模型;采用灌胃给药的方式,2个实验组(药物组)分别给予竹笋提取液复合铁制剂1(0.15%铁卟啉、10%蜂蜜)、制剂2(70%竹笋提取液、0.15%铁卟啉、10%蜂蜜),1个对照组给予同等剂量去离子水,于给药的不同时间点0、18、42、67和90 h从小鼠尾静脉取血,测定血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)、红细胞压积(Hct)。急性毒性试验采用小鼠最大灌胃量给药,观察有无毒性反应。结果制剂2中的竹笋提取液中含有葡萄糖,蛋白质,Na、Cl、Mg、K、Ca、P等多种宏量元素,刺激或参与造血功能的Mn、Fe、Zn、Cu等微量元素,以及促进非血红素铁吸收的多种氨基酸成分;小鼠失血后立刻给药,制剂1与制剂2对失血性贫血的疗效均好于对照组,且制剂2优于制剂1(P<0.05);急性经口毒性动物实验未见异常。结论竹笋提取液含有丰富的葡萄糖、蛋白质以及多种元素,能够刺激造血,扩充血容量,其复合铁制剂对失血性贫血的恢复有促进作用。     

利用新生大鼠建立人/大鼠造血嵌合体模型

本实验旨在通过输注脐血Lin^-细胞，利用新生大鼠建立人／大鼠造血嵌合体模型。将脐血来源的Lin^-细胞移植到正常一级新生SD大鼠的肝脏内，移植后的新生大鼠与同窝未接种的正常新生大鼠共同饲养和观察，于输注Lin^-细胞后2，4和8周时取嵌合鼠的外周血、脾脏等组织，检测人源细胞的比例及人特异性β2-微球蛋白基因片段。结果发现，通过流式细胞术检测到嵌合鼠外周血中存在有一定比例的人源细胞，PCR证明了嵌合鼠脾脏基因组DNA中存在人特异性β2-微球蛋白基因片段。结论：利用新生大鼠可以建立人造血嵌合体，它为今后利用此实验模型进行人造血干细胞体内生物学特性的检测及其它实验奠定了基础，具有潜在应用价值。     

造血干/祖细胞体外定向诱导分化为粒细胞的研究

为探讨利用人造血干/祖细胞体外定向诱导分化的人粒细胞应用于临床大剂量放，化疗后预防感染的可行性，利用源自人胎盘脐带血的CD34^ 细胞及SCF，IL-3，IL-6和G-CSF的细胞因子组合的培养条件。体外进行向粒细胞的诱导分化。结果表明，在该体系条件下可诱导分化出约1000倍数量的细胞，流式细胞仪检测诱导效率可达60%以上。且诱导分化的细胞染色体未出现异常。裸鼠致瘤实验表明该细胞不具致瘤性。细胞体外生长14-21天为高峰，33天后细胞不再增殖，且诱导分化出的细胞具有吞噬细菌的功能。结论：利用细胞工程的方法体外“生产”出的粒细胞具有应用安全性，且具备生理状态下产生的此种细胞应具备的基本功能。为其临床应用提供了基础。     

明胶酶在脑胶质瘤大鼠中的活性

目的:通过观察脑胶质瘤大鼠动物模型中明胶酶的活性变化,为以明胶酶为靶点的脑胶质瘤治疗奠定实验基础。方法:实验于2004-10/2005-12在解放军军事医学科学院野战输血研究所干细胞生物学研究室完成。9L大鼠胶质瘤细胞购自广州南方医科大学。①选取清洁级健康成年雄性Fisher344大鼠27只,24只建立大鼠脑胶质瘤模型,造模后随机数字表法分为建模后7,14,21,28d组,6只/组,每组3只用于灌注固定做免疫组化分析,另3只用于反转录多聚酶链反应和明胶酶谱分析。剩余3只大鼠作为正常对照。②采用反转录多聚酶链反应技术、免疫组织化学和明胶酶谱等方法检测胶质瘤中明胶酶2(matrixmetalloproteinase2,MMP-2)和明胶酶9(matrixmetalloproteinase2,MMP-9)的活性变化。结果:实验选取清洁级健康成年雄性Fisher344大鼠27只,全部进入结果分析。①MMP-2和MMP-9mRNA的表达:9L胶质瘤细胞中均可见MMP-2和MMP-9mRNA的表达,MMP-2的表达量高于MMP-9;大鼠脑胶质瘤组织中可见两者mRNA的表达,而正常脑组织MMP-2mRNA低表达,检测不到MMP-9mRNA的表达;随着肿瘤的生长,MMP-9mRNA的表达量增高。②MMP-2和MMP-9免疫组织化学观察结果:9L胶质瘤细胞的免疫组化显示,MMP-2和MMP-9均呈现阳性染色,主要为胞浆和胞膜染色;肿瘤组织MMP-2和MMP-9染色阳性,为胞浆染色,在血管内皮和肿瘤侵袭边缘细胞胞阳性染色明显。随脑胶质瘤的生长,MMP-2和MMP-9染色程度加深。③MMP-2和MMP-9酶活性检测结果:9L细胞无血清培养上清中可见Pro-MMP2(Mr72000)与Pro-MMP9(Mr92000)及其活化形式activeMMP-2(Mr66000)与activeMMP-9(Mr83000)的表达,MMP-2的表达量较高;MMP-2酶原与活化的MMP-2在脑胶质瘤组织中明显表达,而在正常脑组织低表达。MMP-9酶原与活化的MMP-9在脑肿瘤组织中表达,正常脑组织中未检测到其表达。④MMP-2和MMP-9在肿瘤组织中的定位情况:脑胶质瘤组织冰冻切片原位明胶酶谱结果显示,肿瘤组织因表达活性的明胶酶降解载片上的明胶,致使不被染色,肿瘤部位很透亮。对侧脑组织因不表达明胶酶,不能降解明胶,被染黑。结论:脑胶质瘤模型中表达高活性的MMP-2和MMP-9,且与胶质瘤生长速度密切相关。     

活体成像观察骨髓间充质干细胞向胶质瘤的趋化

目的 观察大鼠BMSCs在颅内的分布及向肿瘤的趋化能力.方法 分离、纯化、培养大鼠BMSCs,检测其表面抗原,并构建稳定表达海肾荧光素酶(RL)的BMSCs(BMSCsRL);采用立体定向手术,在Fischer大鼠脑实质接种PKH26标记的9L胶质瘤细胞:接种胶质瘤细胞后7d应用立体定向仪于胶质瘤对侧脑实质接种BMSCsRL.通过Xenogen活体动物体内成像系统监测BMSCsRL在颅内的分布情况,同时通过Transwell板观察体外BMSCs向肿瘤迁移的情况.结果从大鼠骨髓分离的BMSCs的CD90和CD44阳性率为99%;BMSCs有向肿瘤组织趋化的能力,体外实验发现迁移的细胞数量随9L细胞的增多而增多,在体实验中通过生物发光成像技术观察到在接种后0,7,14 d BMSCs向肿瘤组织迁移,且在肿瘤与正常脑组织交界处最为明显.结论 BMSCs对胶质瘤有明显趋化性,能从远处向胶质瘤组织迁移并定位于其中,提示BMSCs可作为一种潜在的细胞载体用于神经胶质瘤的靶向治疗.     

腺病毒介导CTLA4Ig及CTLA4双基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的制备CTLA4Ig及CTLA4双基因共表达腺病毒载体,检测重组腺病毒在骨髓间充质干细胞(BMMSCs)中的表达。方法构建大鼠CTLA4Ig融合基因,将CTLA4Ig及CTLA4基因经IRES2连接,通过同源重组获得重组腺病毒表达载体,并在293细胞中进行病毒包装和扩增。检测CTLA4Ig和CTLA4在BMMSCs中的共表达情况及其免疫抑制功能。结果通过同源重组获得携带CTLA4Ig-IRES2-CTLA4的重组腺病毒表达载体,PacⅠ酶切鉴定正确,与脂质体共转染293细胞获得重组腺病毒。用重组腺病毒感染的BMMSCs可同时表达CTLA4Ig及CTLA4,且此类细胞具有明显抑制淋巴细胞反应的功能。结论重组腺病毒感染的BMMSCs可同时表达分泌型CTLA4Ig和膜结合型CTLA4,通过阻断协同刺激通路方式进一步增强BMMSCs的免疫抑制功能。     

自体BMSCs复合胶原膜修复猪全层皮肤缺损

目的 探讨自体BMSCs与胶原膜复合构建组织工程皮肤修复小型香猪全层皮肤缺损,为组织工程皮肤的临床应用提供实验依据.方法 取4只贵州小型香猪骨髓各20 mL培养BMSCs,传至第3代.取新鲜牛肌腱通过化学交联的方法制备成直径为5 cm的圆形Ⅰ型胶原膜.将密度为2×107个/mL第3代BMSCs用DAPI标记后种植到Ⅰ型胶原膜上孵育24 h,制备组织工程皮肤.在猪背部正中线两侧分别由前向后切取5个直径5 cm、深达筋膜的圆形全层皮肤缺损创面,随机分为两组(n=10).对照组行单纯Ⅰ型胶原膜修复,实验组行组织工程皮肤修复.于术后3、8周,观察创面愈合情况,并取材行HE染色及透射电镜观察,并于术后3周对实验组行荧光显微镜及糖原染色观察.结果 动物均存活至实验完成.术后3周对照组创面约40%皮肤发黑、结痂、坏死,8周时仍见坏死组织且瘢痕挛缩明显;术后3周实验组创面皮肤成活,无明显瘢痕形成,8周创面愈合良好;两组创面愈合率差异有统计学意义(P<0.01).组织学观察:术后3周对照组可见肉芽组织增生,无表皮层覆盖:实验组具有良好的表皮和真皮结构,糖原染色可见基底膜呈完整连续深红染色.术后8周两组均形成正常皮肤样结构.透射电镜观察:术后3周对照组真皮层有大量中性粒细胞和成纤维细胞,未见表皮超微结构;实验组可见大量表皮细胞并以桥粒相连,表皮基底细胞与基膜以半桥粒连接:真皮层可见大量成纤维细胞,以及细胞外大量胶原微纤维沉积,可见内皮细胞形成的毛细血管.术后3周实验组荧光显微镜观察,带有DAPI标记的BMSCs定位于重建的表皮和真皮组织中,表皮主要定位于基底膜附近,真皮层可见大量荧光标记的BMSCs.结论 以自体BMSCs为种子细胞与胶原膜复合构建组织工程皮肤,可有效修复猪全层皮肤缺损,有望成为一种较理想的组织工程皮肤.     

肝细胞条件培养液对人脂肪问充质干细胞向肝细胞分化和增殖的作用

目的 探讨人脂肪间充质干细胞在改良的诱导体系下向肝细胞的分化和增殖情况,为肝组织工程提供新的种子细胞来源.方法 从人脂肪组织分离出脂肪间充质干细胞,用含有碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4的肝细胞诱导液进行诱导,并于诱导7 d后加入抑瘤素M.用细胞计数试剂盒-8法检测整个诱导过程细胞的增殖情况;通过光学显微镜观察诱导细胞的形态变化;用RT-PCR法和免疫荧光法分别检测肝细胞特异性基因和蛋白的表达;并对多种肝细胞特异性功能进行检测.组间比较采用t-test检验.结果 用改良肝细胞诱导液培养的人脂肪间充质干细胞在培养第5、7、14、21天时,细胞数均明显多于用对照培养液培养的细胞(f值分别为6.59、8.69、15.94和24.64,P值均＜0.05).诱导细胞表现出上皮样肝细胞形态,表达肝细胞特异性基因和蛋白;具有多种肝细胞特异性功能,如靛青绿摄取/排泌、糖原合成以及白蛋白分泌功能.结论 人脂肪间充质干细胞在含碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4和抑瘤索M的诱导体系中能够分化为更加成熟的具有多种肝细胞特异性功能的细胞,且此诱导体系同时具有促进细胞增殖的作用.