嗜水气单胞菌TaqMan实时PCR检测方法的建立

Objective To develop a TaqMan real-time PCR for the detection of aeromonas hydrophila. Methods The conserved region of major adhesion gene of aeromonas hydrophila (aha) was used to design primers and TaqMan probe. A total of six concentration gradients for forward and reverse primers ranging from 200 -700 nmol/L were chosen, and four concentration gradients for probe ranging from I00 -400 nmol/L were chosen. And then the concentration of primers and probe were optimized by ANOVA of completely randomized design respectively. The specificity of the established method was evaluated by using bacteria as contrast, including 45 strains Vibrio cholerae,20 strains Vibrio parahemolyticus, 10 strains Vibrio fluvialis,4 strains Vibrio mimicus,5 strains Vibrio vulnificus, 1 strain Vibrio aiginoayticns, 1 strain Vibrio furnissii, 5 strains Salmonella, 10 strains Shigella and 2 strains Piesiomonas shigelloides. The sensitivity, bacterial sensitivity and DNA sensitivity included,were evaluated. The stool of healthy people was contaminated by aeromonas hydrephila artificially, and the ability of the established TaqMan real-time PCR system for detection of aeromonas hydrophila was also evaluated. Results The cycle threshold (Ct) value deserved from 6 groups of primers concentration gradient was (x±s) :20.69±0.33,20.72±0.21,20.81±0. 12,20.74±0.12,20.51±0. 16 and 20.69±0. 11, respectively, and the concentration of forward primer and reverse primer was determined to be 200 nmol/L (F=1.33, P=0. 28). The Ct value deserved from 4 groups of probe concentration gradient was (x±s) : 20.56±0. 08,20.82±0.05,20. 82±0. 11 and 20.93±0.09,respectively,and the concentration of probe was determined to be 100 nmol/L(F =5.26,P =O. 01 ). The bacterial sensitivity and DNA sensitivity were 80 CFU/ml and 100 fg/μl respectively,and the sensitivity to detect aeromonas hydrophila from stool was 8 × 103 CFU/ml, which might be 8 CFU/ml after 8 hours' enrichment. No amplification was observed in the templates of other bacterial. Conclusion The TaqMan real-time PCR method targeting the aha gene of aeromonas hydrophila had a high sensitivity and specificity and might be used to detect aeromonas hydrophila from pure bacterial and stool rapidly.     

一株同时携带SGI1和SXT/R391耐药基因岛的奇异变形杆菌

目的分析1株人源奇异变形杆菌CA151922的2个耐药相关基因岛SGI1和SXT/R391的基因结构和耐药基因。方法聚合酶链式反应（PCR）检测SGI1和SXT/R391基因岛特异性整合酶基因,采用二代测序方法测定CA151922基因组。 分别以SGI1和SXT/R391基因岛的参考序列,从基因组序列中提取基因岛片段并组装。 在线预测并注释开放读码框（ORFs）。 基因岛的同源序列通过在线工具BLASTn获得,采用cd-hit获得非冗余的同源基因,利用R语言构建同源基因的聚类进化关系树。 利用微量肉汤稀释法进行耐药表型检测。结果奇异变形杆菌CA151922同时含有SGI1（SGI1-B）和SXT/R391（ICEPmiJpn1）2个耐药相关基因岛。 SGI1-B和ICEPmiJpn1与已知序列相似性分别为97% ~ 99%和96% ~ 99%。 SGI1-B和ICEPmiJpn1携带的耐药基因种类有所差异,但两者携带不同的编码β-内酰胺酶的基因。CA151922为多耐药菌株,耐药达18种,与基因岛耐药基因有关的耐药表型为氨苄西林和磺胺类药物,提示菌株耐药表型不完全由该耐药岛内的耐药基因决定。结论首次在奇异变形杆菌中发现,同时携带SGI1和SXT/R391耐药相关基因岛, 增加了菌株耐药的复杂性和严重性,提示应加强对多耐药菌株耐药相关基因岛的监测。     

麦氏弧菌多位点序列分型方法的建立与应用

目的建立针对麦氏弧菌的多位点序列分型（MLST）方法,评价该方法的分型效果,并对收集的麦氏弧菌进行MLST分析。方法筛选出7个管家基因（ftsZ、gapA、mreB、gyrB、purM、recA、ropA）,设计特异引物,在17株麦氏弧菌中PCR扩增管家基因序列。 用DnaSP 6.12.03软件和Split tree 4.0软件评价基因多态性、中性进化和基因重组情况;根据7个管家基因的序列差异获得对应的序列分型（ST）型别,用BioNumerics 7.1软件对不同ST型别构建最小生成树和聚类图,并用eBURST 3.0软件计算克隆复合体（CCs）。结果所选的管家基因具有足够多的等位基因位点、序列差异和足够高的分辨率;7个管家基因的Split tree对所有麦氏弧菌的聚类一致;中性试验结果显示,7个管家基因在进化过程中受遗传漂变的影响较小。 MLST将17株麦氏弧菌分成14个ST型别,大多数菌株（64.70%）均单独形成一个ST型别,其中ST007形成了可能的优势克隆群。 这些菌株之间存在相对较远的遗传距离,在垂直传播上呈现出潜在的地域聚集性。结论本研究建立的麦氏弧菌的MLST方法能分析麦氏弧菌的种群结构和遗传进化关系。     

气单胞菌研究概况

气单胞菌在自然界分布广泛,除引发鱼类疫病外也可导致人体不同部位的感染,东南亚国家是腹泻病相对高发的地区,对肝胆外科术后病例有较高的机会性感染和疾病负担;全球耐药特征呈上升趋势,多重耐药（MDR）和超广谱-内酰胺酶（ESBLs）菌株与水产养殖业的抗生素过度使用后环境污染有关;不同地域气单胞菌的毒力因子存在差异。有关部门应制定措施控制水源、食品与养殖环境,降低肠道和非肠道感染的疾病负担。     

实时聚合酶链反应检测O1群和O139群霍乱弧菌方法的建立及应用

目的建立检测O1群和O139群霍乱弧菌的实时荧光聚合酶链反应（RT—PCR）方法并进行水体标本的检测评价。方法根据O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb序列设计引物，利用SYBRGreen染料，建立同时检测霍乱弧菌O1群和O139群的RT—PCR方法，对所建立的方法分别进行实验室内的灵敏度、特异性及重复性评价。采集河口水标本增菌后进行RT—PCR检测，与分离培养方法比较评价实际应用价值。结果建立了检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重RT—PCR方法，根据扩增产物的溶解温度能有效区分O1群和O139群霍乱弧菌两种目标片段的扩增；对其他10种弧菌染色体DNA没有扩增；RT—PCR检测524份河口水体标本的增菌液，与常规分离方法相比显示了明显的灵敏性，并且所有常规分离方法阳性标本其荧光PCR检测亦为阳性。结论以O1群和O139群rfb基因为目标检测片段建立的霍乱弧菌RT—PCR方法可用于环境水体样本中霍乱弧菌常规分离前的快速筛查。     

克雷伯菌16S rDNA和rpoB基因系统进化及序列特征分析

目的 比较分析克雷伯菌属的种之间16S rDNA和rpoB系统进化发育关系和序列进化特征.方法 选取经生化鉴定的克雷伯菌18株,提取菌株染色体作为模板,分别使用16S rDNA和rpoB通用引物扩增并测序16S rDNA和rpoB序列.与GenBank中目前已公布的8种克雷伯属菌株16S rDNA和rpoB序列各8条、除克雷伯菌外其他肠道菌株的16S rDNA和rpoB序列各9条一起,共计各35条16SrDNA和rpoB序列,在MEGA 4.0中建立进化树并进行分群分析,使用DNAStar/MegAlign程序比较分析8种克雷伯菌的种间16S rDNA和rpoB序列变异碱基位点,并做分歧度分析.结果 在所有受试的16SrDNA和rpoB的各35条序列中,16S rDNA和rpoB进化发育树都将克雷伯菌区分为3个群:分离的18株克雷伯菌中,15株肺炎亚种与GenBank中除产酸克雷伯菌和运动克雷伯菌外的其余6种克雷伯菌聚为一群(Ⅰ),其余3株克雷伯菌(FX246、FX280和FX286),经生化鉴定为产酸克雷伯菌,与GenBank中产酸克雷伯菌(DQ835530)聚为一群(Ⅱ);而GenBank中的运动克雷伯菌单独聚为一群(Ⅲ);进一步的分析,在rpoB进化发育树中,无沦足Ⅰ群和Ⅱ群,还足Ⅰ群内的两个亚群,rpoB进化发育树的结点处自引导值都明显高于16S rDNA进化发育树;而且rpoB对产酸克雷伯菌的分群优于16S rDNA.对克雷伯菌的序列分析发现,16S rDNA序列存在41个碱基变异位点,有4个易变区,rpoB序列存在63个碱基变异位点,有1个易变区;克雷伯菌16S rDNA和rpoB的相似性分别为95.9%～100%和90.2%～100%.进一步的克雷伯菌种间序列分歧值分析,rpoB分歧值(0～10.6)高于16S rDNA(0～4.0).结论 克雷伯菌rpoB比16S rDNA具有更高的分歧度,在克雷伯菌属内种的分子分类和鉴定中,rpoB比16S rDNA基因更具优越性.     

嗜水气单胞菌TaqMan实时PCR检测方法的建立

Objective To develop a TaqMan real-time PCR for the detection of aeromonas hydrophila. Methods The conserved region of major adhesion gene of aeromonas hydrophila (aha) was used to design primers and TaqMan probe. A total of six concentration gradients for forward and reverse primers ranging from 200 -700 nmol/L were chosen, and four concentration gradients for probe ranging from I00 -400 nmol/L were chosen. And then the concentration of primers and probe were optimized by ANOVA of completely randomized design respectively. The specificity of the established method was evaluated by using bacteria as contrast, including 45 strains Vibrio cholerae,20 strains Vibrio parahemolyticus, 10 strains Vibrio fluvialis,4 strains Vibrio mimicus,5 strains Vibrio vulnificus, 1 strain Vibrio aiginoayticns, 1 strain Vibrio furnissii, 5 strains Salmonella, 10 strains Shigella and 2 strains Piesiomonas shigelloides. The sensitivity, bacterial sensitivity and DNA sensitivity included,were evaluated. The stool of healthy people was contaminated by aeromonas hydrephila artificially, and the ability of the established TaqMan real-time PCR system for detection of aeromonas hydrophila was also evaluated. Results The cycle threshold (Ct) value deserved from 6 groups of primers concentration gradient was (x±s) :20.69±0.33,20.72±0.21,20.81±0. 12,20.74±0.12,20.51±0. 16 and 20.69±0. 11, respectively, and the concentration of forward primer and reverse primer was determined to be 200 nmol/L (F=1.33, P=0. 28). The Ct value deserved from 4 groups of probe concentration gradient was (x±s) : 20.56±0. 08,20.82±0.05,20. 82±0. 11 and 20.93±0.09,respectively,and the concentration of probe was determined to be 100 nmol/L(F =5.26,P =O. 01 ). The bacterial sensitivity and DNA sensitivity were 80 CFU/ml and 100 fg/μl respectively,and the sensitivity to detect aeromonas hydrophila from stool was 8 × 103 CFU/ml, which might be 8 CFU/ml after 8 hours' enrichment. No amplification was observed in the templates of other bacterial. Conclusion The TaqMan real-time PCR method targeting the aha gene of aeromonas hydrophila had a high sensitivity and specificity and might be used to detect aeromonas hydrophila from pure bacterial and stool rapidly.     

河弧菌Taqman实时荧光PCR检测方法建立

目的 建立以Taqman实时PCR检测河弧菌的方法.方法 根据河弧菌toxR基因的保守序列设计引物和Taqman探针,建立检测河弧菌的实时PCR方法;对引物和探针的浓度进行优化,对优化后建立的方法分别进行实验室内的灵敏度和特异性评价,并与常规PCR比较.结果 建立了检测河弧菌的实时PCR方法,经优化该方法选择引物的浓度为100 nmol/L,探针浓度为200 nmol/L;该方法对纯菌的检测下限为4.17×102cfu/mL,比常规PCR高1000倍;针对toxR基因建立的河弧菌实时PCR方法,对8种其他弧菌和肠道细菌的染色体无扩增.结论 建立的方法能够特异和敏感地检测河弧菌,可用于河弧菌的快速筛检.     

血清凝集、基因测序联合检测群霍乱弧菌的应用

目的 避免霍乱弧菌检测假阳性,提高检测正确率。方法 随机选取2013年1～7月,全国各省市CDC送往中国CDC霍乱初筛阳性菌株14株; 用LB营养琼脂培养12 h,挑取单菌落进行霍乱弧菌血清凝集,同时水煮模板法提取菌株的DNA。针对弧菌属16SrDNA序列设计引物,进行弧菌16SrDNA PCR检测,电泳观察16SrDNA产物,将16SrDNA阳性产物送测序公司测序,测序结果在NCBI网站上进行Blast比对,分析比较血清凝集和Blast比对结果。结果 共选取14株菌进行实验,血清凝集阳性12株,2株未凝。经弧菌16SrDNA扩增,电泳观察14株菌均扩增出相应的片段,说明所选菌株均为弧菌属。将14株菌的16SrDNA阳性产物测序,并将测序结果进行Blast比对:2株血清未凝集菌均是哈维氏弧菌; 12株血清凝集阳性的菌中,1株是需钠弧菌,其余11株是霍乱弧菌。结论 血清凝集和基因测序联合检测群霍乱弧菌,可避免霍乱弧菌检测假阳性,提高检测正确率。     

马鞍山市2008年食品中变形杆菌监测及分子特征分析

目的了解2008年马鞍山市监测食品中变形杆菌的检出情况,更好地对变形杆菌引起的腹泻进行预防与控制。方法采集2008年在马鞍山市的超市、批发市场、水产基地以及疑似食物中毒的熟食采集样品,按GB/T4789-2003、WS/T9-1996方法进行变形杆菌分离检测,分离菌株采用VITEK-32微生物鉴定系统进行药敏鉴定,同时进行PFGE分型,分析不同来源菌型之间的同源性。结果共采集各类食品230份,变形杆菌检出率为20.87%(48/230),其中普通变形杆菌为13.91%(32/230),奇异变形杆菌为6.96%(16/230)。在不同类食品中,检出率最高的是禽肉类样本29.09%(16/55),其后依次为鱼虾样本28.75%(23/80)、禽蛋样本13.33%(2/15)、熟食类样本12.5%(1/8)和畜肉类样本10.17%(6/59)。48株变形杆菌的PFGE分为28个型,其中普通变形杆菌为17个型、奇异变形杆菌为11个型,各型之间不紧密相关。经耐药分析,菌株对四环素、氨苄青霉素、头孢噻吩、复方新诺明及呋喃妥因耐药性70%,而对头孢吡肟、头孢他啶、氟哌酸、环丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、丁胺卡那霉素和妥布霉素敏感性68%。结论马鞍山市食品中变形杆菌的污染来源于不同的克隆株,未发现单个基因型菌株流行的迹象。