阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者3种GPI锚定蛋白表达的改变

目的 比较阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者血细胞表面3种糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白表达情况。方法 流式细胞术检测25例PNH患者粒细胞表面GPI锚定蛋白CD55、CD59和CD87的表达水平，并分析它们在不同疾病状态下的改变。结果 PNH患者粒细胞表面3种GPI锚定蛋白间具有较好的相关性(P均＜0．05)，红细胞表面CD55和CD59也表现出相关(P＜0．01)，但与粒细胞表面CD55和CD59的缺乏情况并不一致。结论 PNH患者同一系血细胞表面GPI锚定蛋白呈平行关系，这有助于对PNH发病机制的进一步了解。     

人vWF-A1区蛋白的表达及其对血小板聚集的抑制作用

目的:进一步研究血栓形成的机制,开发抗血栓药物。方法: 应用基因重组技术在大肠杆菌中表达人vWF-A1区蛋白,经过纯化、复性,获得重组蛋白(rvWF-A1),同时用流式细胞术检测rvWF-A1与血小板膜糖蛋白血小板膜糖蛋白(glycoprotein, GP)Ib的结合能力,应用血小板聚集仪测定rvWF-A1对瑞斯托霉素(ristocetin)诱导的血小板聚集抑制作用。结果: 重组表达载体pQE-31-vWF-A1在大肠杆菌M15中得到高效表达,表达的重组蛋白量占菌体总蛋白的30%,Ni-NTA agrose柱纯化后,其纯度为95%,经复性的rvWF-A1蛋白具有良好的生物学活性。它可与血小板模糖蛋白血小板膜糖蛋白GPIb结合,阳性率为78.6%;它可以抑制ristocetin诱导的血小板聚集,抑制率为84.7%。结论: 在原核细胞中可以成功地高效表达人vWF-A1区蛋白,该重组蛋白有可能开发为有效的抗血栓药物。     

再生障碍性贫血免疫抑制治疗后阵发性睡眠性血红蛋白尿症克隆的演变及临床意义

目的 探索再生障碍性贫血(AA)免疫抑制治疗(IST)后阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)克隆变化情况及其临床意义.方法 将2008年1月至2012年2月收治的186例AA患者纳入本研究,其中55例重型AA(SAA)予抗胸腺细胞球蛋白(ATG)联合环孢素A(CsA)治疗,131例非重型AA(NSAA)予CsA治疗.治疗前所有患者进行PNH克隆筛查,治疗后进行随访.中位随访时间22(18 ～76)个月.结果 SAA组10例(18.9％)患者出现PNH克隆,NSAA组9例(7.4％)出现PNH克隆,前者出现PNH克隆比例高于后者(t=5.041,P=0.025),治疗后SAA组在6、12、18、＞24个月时PNH克隆规模大于NSAA组(13.38％比5.67％、14.88％比5.31％、20.00％比5.47％、18.85％比9.08％,P值均＜0.05).PNH克隆对2种IST方案疗效影响的差异无统计学意义.结论 AA患者予ATG联合CsA或CsA治疗后,均可出现PNH克隆,SAA患者ATG治疗后更明显.IST前后伴PNH克隆不影响IST疗效.     

慢性髓细胞白血病急变期的免疫表型和细胞遗传学研究

目的探讨慢性髓细胞白血病急变期(CML-BC)免疫表型和细胞遗传学异常的关系。方法对33例成人CML-BC以四色流式细胞仪进行表面抗原检测及R显带技术进行核型分析。结果典型易位组CD34阳性率高于变异易位组(P＜0．05):无附加异常、伴附加异常、伴复杂染色体异常(CCAs)各组中抗原表达阳性率无统计学差异;平衡易位、非平衡易位组中抗原表达阳性率无统计学差异。涉及17号染色体变异的病例中各抗原的阳性率与CML-BC总体阳性率比较末发现统计学差异。7例涉及17号染色体变异的病例均为CML-AML。结论典型t(9;22)易位CD34阳性率高于变异易位;有无附加染色体异常及是否平衡易位对免疫表型无直接影响。涉及17号染色体变异的CML-BC中急非淋变多见。     

Annexin Ⅱ siRNA对淋巴瘤Jurkat细胞凋亡的影响

目的观察沉默膜联蛋白Ⅱ（annexinⅡ,A2）基因对淋巴瘤Jurkat细胞凋亡的影响。方法采用A2 siRNA转染人淋巴瘤Jurkat细胞后应用RT-PCR和Western blot鉴定干扰效果。Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响。结果Real-time PCR和Western blot检测结果表明,A2基因被成功抑制。流式细胞术检测得A2siRNA组细胞凋亡率为57.47%±2.10%,较阴性对照组（28.68%±1.21%）明显增加,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论A2基因可增强Jurkat细胞抗凋亡作用,A2 siRNA可诱导Jurkat细胞凋亡。     

抗血小板膜糖蛋白SZ-21单链抗体的制备和生物学特性研究

目的：将能与血小板膜糖蛋白Ⅲa特异结合的单克隆抗体SZ－21构建成单链抗体（SZ－21ScFv)，为其临床应用奠定基础。方法：构建SZ－21ScFv基因的质粒pET20b-21ScFv，在大肠杆菌E coli BL21(DE3)PlysS中表达了功能分子。表达产物经过包涵体的溶解、Ni-NTA树脂亲和吸附纯化和蛋白质的体外复性过程，获得具有生物活性的高纯度单链抗体片段。结果：体外实验证实表达量占菌体蛋白的21％。SZ-21单链抗体能够抑制ADP诱导的血小板聚集，其抑制能力呈剂量依赖性，在浓度为20μg/ml时达到最大抑制率。 流式细胞术检测证实该单链抗体能与内皮细胞反应，同时也可以抑制纤维蛋白原与血小板的结合。结论：表达的单链抗体具有抑制血小板聚集和抑制纤维蛋白原与血小板结合的能力，有望用于血栓性疾病的治疗。     

全反式维甲酸对于难治性ITP的疗效观察及其机理探讨

目的探讨加用全反式维甲酸ATRA对难治性特发性血小板减少性紫癜（RITP）的疗效及对患者外周血调节性T（CD4^＋CD25highT）细胞表达和辅助性T（Th）细胞因子的影响。方法应用流式细胞术测定28例RITP患者ATRA治疗前后及17例正常人外周血cD4^＋cD25^highT细胞的表达;ELISA法测定血清中转化生长因子β1（TGF—B1）、白介素（IL）-10、IL-4、IL-2、干扰素1（IFN-1）。结果ATRA对RITP的总有效率为53．6％,有效组治疗后患者外周血血小板计数达109．1±30．1×109／L,较治疗前明显升高（P〈0．01）;治疗有效组经ATRA治疗后CD4’CD25highT细胞阳性率及血清TGF—β1与IFN—γ水平高于治疗前（P〈0．05）;IL-4则明显低于治疗前（P〈0．05）;IL-2和IL-10治疗前后未见异常。结论ATRA对半数以上RITP患者有效,可能是通过提高调节性T细胞的表达,促进了RITP患者免疫紊乱向生理性平衡恢复。     

CD40L在特发性血小板减少性紫癜患者中的表达及其意义

目的研究特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者血浆中可溶性CD40配体（sCD40L）及T、B淋巴细胞和血小板上CD40L的变化,探讨CD40分子在ITP中的作用。方法应用酶联免疫吸附法检测患者血浆中sCD40L的变化;流式细胞术检测不同细胞上CD40L的表达水平。结果 ITP患者血浆中的sCD40L浓度明显高于正常对照组（P〈0.05）,且血小板计数对血浆中sCD40L浓度有一定程度的影响（r=0.58,P〈0.05）;ITP患者T淋巴细胞上CD40L的表达率较正常对照组明显升高（P〈0.05）。结论 ITP患者血浆及T细胞上CD40L升高,淋巴细胞表面的CD40-CD40L相互作用可能与ITP的发病有关。     

人血小板膜糖蛋白功能测定的酶联免疫分析方法的建立

目的建立测定血小板膜糖蛋白（GP）功能的酶联免疫分析（ELISA）方法 ,并对其灵敏度、批内和批间差异进行方法学考核。方法以抗血小板CD62P单抗SZ51和抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）单抗7E3分别包板,加入经ADP诱导的或未诱导的正常人富含血小板血浆（PRP）,以生物素标记的抗GPIb单抗SZ2（Biotin-SZ2）反应后,加入亲和素标记的辣根过氧化物酶（Avdin-HRP）检测,邻苯二胺（OPD）显色后,酶标仪读取吸光度（A）值。对其灵敏度及批内、批间差异作方法学评估,应用该方法对抑制性单抗SZ-21和阿司匹林抑制血小板活化的功能效果进行测定,并与流式细胞术（FCM）测定结果进行比较。结果该方法可检测血小板计数低达6.25×109/L（SZ51包被板）和3.13×109/L（7E3包被板）的标本,批内和批间变异系数均小于10%。测得50名健康正常人ADP诱导的（未诱导的）血小板的CD62P和GPⅡb/Ⅲa的A值分别为0.68±0.21（0.18±0.09）和0.87±0.29（0.44±0.14）。ELISA测定结果表明,SZ21和阿司匹林可明显抑制ADP诱导的血小板功能。流式细胞仪测定ADP诱导的（未诱导的）人血小板表面CD62P和GPⅡb/Ⅲa的阳性细胞百分率分别为（60.1±7.12）%[（2.56±0.61）%]和（86.32±17.82）%[（20.25±14.56）%],其批内和批间变异系数均〈10%。结论该方法可以测定血小板功能活化剂或抑制剂对血小板功能的影响,可以测定血栓性疾病或血栓形成相关性疾病引起的血小板活化程度。     

BA-ELISA定量检测人血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa、CD62p的表达及其临床应用

目的建立测定血小板膜糖蛋白功能的生物素亲和素酶联免疫吸附（BA-ELISA）方法,并探讨其临床应用价值。方法采用抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）单抗7E3和抗血小板CD62p单抗SZ51及生物素亲和素系统建立BA-ELISA方法,并应用该方法检测50名健康志愿者、30例急性心肌梗死（AMI）、30例急性脑梗死（ACI）和30例糖尿病（DM）患者的血小板膜糖蛋白功能,并与流式细胞术（FCM）测定结果进行比较。同时,应用该方法对抑制性单抗SZ21和阿司匹林抑制血小板活化的功能效果进行测定。结果该方法检测血小板计数敏感度低达3.13×109/L（7E3包被板）和6.25×109/L（SZ51包被板）,批内和批间变异系数分别为6.23%～8.35%和4.38%～5.78%。测得AMI、ACI和DM患者ADP诱导的（未诱导的）血小板的GPⅡb/Ⅲa和CD62p表达量均显著高于健康志愿者（均P〈0.01）。BA-ELISA测定表明,SZ21和阿司匹林可抑制ADP诱导的血小板功能（但P〉0.05）。该方法和FCM同时测定健康志愿者、AMI、ACI和DM患者的GPⅡb/Ⅲa和CD62p表达水平。测定数据经直线回归分析得r=0.86。结论 BA-ELISA检测血小板的膜糖蛋白,可精确判断血小板的功能状态,为指导临床预防、诊治、评估疾病提供简便、可行的方法。活化的血小板膜糖蛋白测定可从凝血的角度对上述疾病的早期诊断、病情进展的判断、抗血栓药物的评估及疾病预后的判断起到辅助作用。