丙型肝炎病毒不同基因型核心蛋白对肝母细胞瘤细胞凋亡影响的比较

目的比较HCV不同基因型核心蛋白(core)在肝母细胞瘤细胞凋亡中的作用。方法构建6a基因型HCV core的表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)-core(6a)[pCore(6a)];分别将1b、3a和6a基因型HCV core质粒以及空质粒pcDNA3.1/myc-His(-)(pNC)瞬时转染HepG2细胞,48小时后利用流式细胞术检测细胞凋亡发生的情况;利用Real-time PCR检测胱冬肽酶-3的mRNA水平变化;利用化学发光法检测胱冬肽酶-3的活性变化,比较HCV不同基因型core对细胞凋亡作用的差异。结果成功构建了6a基因型HCV core的表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)-core(6a)[pCore(6a)];与pNC组相比,表达1b、3a和6a基因型HCV core的HepG2细胞中,Annexin V+细胞数均显著减少,其中6a基因型core较1b和3a基因型core作用显著(P=0.000、0.001);同时实验组中凋亡效应分子胱冬肽酶-3的mRNA水平及其活性较对照组均降低;其中与1b和3a基因型core相比较,6a基因型core显著降低胱冬肽酶-3的mRNA水平,而在抑制胱冬肽酶-3活性方面无显著差别。结论 HCV不同基因型core对细胞凋亡的作用不同;基因6a型core对细胞凋亡的抑制作用更为显著;HCV基因6型核心蛋白可能更易导致肝癌的发生,有待进一步研究。     

肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗菌药物的基因型研究

目的：探讨肺炎克雷伯菌（Kpn）耐碳青霉烯类药物的耐药基因型。方法收集2011年1月至12月本院分离到的肺炎克雷伯菌,用K-B法进行药敏实验,筛选出6株耐碳青霉烯类抗菌药物的肺炎克雷伯菌（CRKP）,采用改良Hodge试验检测菌株产碳青霉烯酶,用乙二胺四乙酸（EDTA）纸片法检测金属酶表型,聚合酶链式反应（PCR）鉴定肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯酶（KPC）基因及其他β-内酰胺酶基因。结果6株CRKP对头孢噻肟、头孢他啶、头孢呋辛、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、复方新诺明、哌拉西林/三唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、氨曲南、美罗培南、亚胺培南均耐药,对多黏菌素、米诺环素、磷霉素、阿米卡星等敏感,改良Hodge试验提示6株CRKP均产碳青霉烯酶,EDTA纸片法检测显示不产金属酶;PCR鉴定出该6株CRKP均携带blaKPC-2型基因,部分菌株携带blaSHV及blaTEM型广谱β-内酰胺酶耐药基因。结论 BlaKPC-2耐药基因为Kpn对碳青霉烯类药物耐药的主要原因。     

人肝细胞生长因子转染L02细胞的锌指基因差异表达筛选

目的构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达载体,在L02细胞中表达hHGF并筛选其中的差异表达基因。方法构建pcDNA3.1(-)-hHGF载体,测序鉴定;其转染L02细胞后进行蛋白免疫印迹检测;将pcDNA3.1(-)-hHGF和pcDNA3.1(-)载体分别转染L02细胞后,提取总mRNA并逆转录为cDNA,运用基因表达谱芯片技术分析差异表达基因。结果构建的hHGF真核表达载体pcDNA3.1(-)-hHGF经酶切和测序鉴定正确;转染L02细胞后经蛋白免疫印迹证实hHGF存在明确表达;pcDNA3.1(-)及pcDNA3.1(-)-hHGF分别转染L02细胞后提取总RNA,经基因表达谱芯片分析发现,表达水平显著上调和下调的基因分别有404个和145个,在表达显著上调的基因中包含7种锌指基因。结论筛选出了hHGF转染L02细胞后的差异表达基因,为其作用机制及与锌指蛋白相关性的研究提供了重要依据。     

202例老年重型肝炎病因学及预后分析

目的探讨老年重型肝炎病因学及预后的相关特点。方法将本院10年来诊治的202例老年重型肝炎患者与同期2138例中青年重型肝炎患者作对照,比较两个年龄组急性重型肝炎（ALF）、亚急性重型肝炎（SLF）、慢性重型肝炎（CLF）的患病率、病因学及转归情况。结果两个年龄组重型肝炎均以CLF为主（老年组63.3%,中青年组83.7%）,而老年组中SLF所占的比率（30.6%）显著高于中青年组（12.6%）。导致老年重型肝炎的前3位病因依次为：乙型肝炎（56.4%）、戊型肝炎（19.8%）、未分型肝炎（10.9%）;两组重型肝炎患者治疗无效病例老年组为63.9%,中青年组为52.4%,差异具有统计学意义（P〈0.05）,且重型肝炎老年组中SLF和CLF治疗无效病例显著高于中青年组;导致重型肝炎老年组预后不佳的前3位病因依次为：乙型肝炎（65.1%）、戊型肝炎（13.2%）、未分型肝炎（7.0%）;因戊型或乙型肝炎病毒感染发展至重型肝炎的老年患者治疗无效病例分别为44.7%和73.7%,显著高于中青年组的24.5%和54.8%（P〈0.05）。结论老年重型肝炎以CLF为主,病因主要为乙型肝炎、戊型肝炎、未分型肝炎;老年重型肝炎多预后不良,且导致治疗无效的病因主要为乙型肝炎、戊型肝炎和未分型肝炎。老年患者在戊型和乙型肝炎病毒感染后应警惕重型肝炎的发生。     

HCV NS5A结合蛋白顺乌头酸酶1的验证研究

目的筛选人肝脏cDNA文库中与HCV NS5A的结合蛋白基因,验证其中顺乌头酸酶1与HCV NS5A的相互作用。方法应用酵母双杂交系统3筛选人肝脏cDNA文库中的HCV NS5A结合蛋白基因,应用哺乳动物双杂交及免疫共沉淀技术验证其中顺乌头酸酶1蛋白与HCV NS5A之间的相互作用。结果成功筛选出人肝脏cD-NA文库中与HCV NS5A存在相互作用的蛋白基因,哺乳动物双杂交及免疫共沉淀实验结果证实HCV NS5A与顺乌头酸酶1蛋白在HepG2细胞内存在相互作用。结论本实验成功筛选人肝脏cDNA文库中的HCV NS5A结合蛋白基因,并且在体外水平即细胞内证实HCV NS5A与其中的顺乌头酸酶1蛋白之间的相互作用,为进一步细胞内及体内的糖、脂类代谢等功能研究奠定基础。     

糖尿病对肝硬化患者并发自发性细菌性腹膜炎的影响

目的 探讨合并糖尿病对肝硬化患者并发自发性细菌性腹膜炎(SBP)的影响.方法 选择2000年1月～2004年12月收治的肝硬化合并腹水患者3079例,在腹水细菌培养阳性的148例患者中,合并糖尿病患者49例(合并糖尿病组),未合并糖尿病患者99例(非合并糖尿病组);肝硬化合并糖尿病的405例患者中,根据有无SBP又分为SBP组(246例)和无SBP组(159例).记录相关情况并进行分析.结果 在腹水细菌培养阳性的患者中,合并糖尿病组患者转归差,且真菌感染和混合感染发生率高.在肝硬化合并糖尿病的患者中,SBP组转归差.结论 肝硬化患者合并糖尿病时更易并发SBP,且抗感染疗效及预后差,更易发生真菌及混合感染;糖尿病与感染间存在相互作用.     

糖尿病对肝硬化患者并发自发性细菌性腹膜炎的影响

目的探讨合并糖尿病对肝硬化患者并发自发性细菌性腹膜炎（SBP）的影响。方法选择2000年1月-2004年12月收治的肝硬化合并腹水患者3079例，在腹水细菌培养阳性的148例患者中，合并糖尿病患者49例（合并糖尿病组），未合并糖尿病患者99例（非合并糖尿病组）；肝硬化合并糖尿病的405例患者中；根据有无SBP又分为SBP组（246例）和无SBP组（159例）。记录相关情况并进行分析。结果在腹水细菌培养阳性的患者中，合并糖尿病组患者转归差，且真菌感染和混合感染发生率高。在肝硬化合并糖尿病的患者中，SBP组转归差。结论肝硬化患者合并糖尿病时更易并发SBP，且抗感染疗效及预后差，更易发生真菌及混合感染；糖尿病与感染间存在相互作用。     

HBsAg结合胰腺细胞蛋白基因的酵母双杂交技术筛选

目的 应用酵母双杂交技术筛选胰腺细胞cDNA文库中与HBsAg相互作用的结合蛋白的基因.方法扩增人胰腺cDNA文库并纯化鉴定,将其转人酵母菌Y187;诱饵质粒PGBKT7-HBSAg转入酵母菌AH109.将以上二者进行配合,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和X-a-Gal培养基上进行双重菌落筛选;提取阳性质粒转化大肠埃希菌DH5a并测序,在GenBank中进行生物信息学分析.结果 获得了6个与HBsAg相结合的蛋白,包括顺乌头酸酶、CDK5RAP3、羧肽酶B1、胰脂肪酶、辅脂肪酶、弹性蛋白酶.结论 筛选出的胰腺细胞蛋白与2型糖尿病等代谢性疾病有较密切关系,为进一步研究并阐明乙肝病毒(HBV)感染引发糖脂代谢紊乱机制提供了新的思路.     

NS5 ATP9抑制血清饥饿诱导的HepG2细胞凋亡

目的探讨HCV NS5A反式激活基因NS5ATP9对肝癌细胞系HepG2细胞凋亡的影响。方法将NS5ATP9基因表达质粒、NS5ATP9干扰RNA质粒及各自的对照空质粒转染到HepG2细胞中,48h后换无血清培养基培养24h诱导细胞凋亡,采用实时荧光定量PCR验证转染后NS5ATP9mRNA表达水平的变化,采用Annexin V/7-AAD流式细胞术检测细胞凋亡情况,JC-1检测线粒体膜电位,Western blot检测Bax蛋白表达,综合观察NS5ATP9对HepG2细胞血清饥饿诱导凋亡的影响。结果 Annexin V/7-AAD检测结果显示,和对照组细胞相比NS5ATP9过表达组早期凋亡和总凋亡率显著减少(P0.05);而NS5ATP9干扰RNA组细胞的早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡率均显著增加(P0.05)。JC-1检测结果显示,和对照组相比NS5ATP9过表达组细胞线粒体膜电位保持正常形式的比例增加,而出现去极化电位形式的比例显著减少(P0.05);而NS5ATP9干扰RNA组线粒体膜电位保持正常形式的比例显著减少(P0.05)。Western blot检测结果显示,NS5ATP9干扰RNA组促凋亡分子Bax表达量显著升高(P0.05),NS5ATP9过表达组Bax表达量则有下降趋势。结论 NS5ATP9基因抑制血清饥饿诱导的HepG2细胞凋亡,其机制可能是通过线粒体途径实现。     

HBV表面抗原大蛋白与人胰腺突触角蛋白6之间的相互作用

目的 验证HBV表面抗原大蛋白(LHBs)与人胰腺突触角蛋白6 (STX6)在细胞内是否存在相互作用,为进一步研究HBV影响糖、脂代谢机制奠定研究基础.方法 构建真核表达质粒pACT-STX6,采用哺乳动物双杂交技术验证LHBs与STX6之间的相互作用.结果 实验组和各阴性对照组相对荧光素酶活性值均存在差异,且均具有显著统计学意义(P＜ 0.01).结论 LHBs与人胰腺STX6在胰腺细胞内存在相互作用.