Fe3O4 纳米化颗粒标记人羊膜间充质干细胞的合适条件

目的:Fe3O4 纳米化颗粒是近来发现的活体示踪剂,由于其毒性可导致标记细胞死亡,寻找合适的浓度进行细胞标记已成为活体示踪的关键.实验以人羊膜间充质干细胞作为靶点,探讨Fe3O4 纳米化颗粒标记的合适条件.方法:实验于2007-08在郑州大学完成.①细胞来源及颗粒:人羊膜间充质干细胞由郑州大学第一临床医学院神经外科杨波教授自健康产妇胎盘羊膜中提取,产妇对实验知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准.Fe3O4 纳米颗粒由美国Sigma公司生产,商品名:菲立磁,批号094k0788.转染剂多聚左旋赖氨酸购自大连宝生生物公司,批号033K4351.②实验方法:向人羊膜间充质干细胞加入含10%胎牛血清、20μg/L碱性成纤维生长因子的DMEM/F12培养基,置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,待细胞达80%～90%融合时胰酶消化传代.取传至第3代的细胞,放入含DMEM/F12培养基的10 mL培养瓶中,密度调整为1×109 L-1.设立3组:单纯Fe3O4组分为4个亚组,即向培养基中分别加入终浓度为20,30,40,80 mg/L的Fe3O4纳米颗粒;Fe3O4 多聚左旋赖氨酸组分为4个亚组,即向培养基中分别加入上述终浓度Fe3O4纳米颗粒后,再加入1.5 mg/L多聚左旋赖氨酸;培养基对照组,仅加入DMEM/F12培养基.各组细胞标记12 h后,均更换为DMEM/F12培养基培养3周.③实验评估:分别于标记后12 h、36 h、1周和3周,普鲁士蓝染色检测Fe3O4纳米颗粒进入细胞情况,锥虫蓝染色检测细胞活性.结果:①Fe3O4 纳米颗粒标记人羊膜间充质干细胞的效果:终浓度为20 mg/L的Fe3O4纳米颗粒细胞标记率为60%,终浓度为30,40,80 mg/L的Fe3O4纳米颗粒细胞标记率均为100%.单纯Fe3O4组可见少量蓝染的Fe3O4纳米化颗粒分散于细胞浆内,Fe3O4 多聚左旋赖氨酸组蓝染颗粒明显增多,部分聚集成团.②标记后细胞活性测定:与培养基对照组比较,当Fe3O4终浓度为20,30 mg/L时,单纯Fe3O4组、Fe3O4 多聚左旋赖氨酸组细胞活性均无明显变化(P > 0.05);当Fe3O4终浓度升高至40,80 mg/L时,上述2组细胞活性均显著降低(P < 0.05).结论:①与多聚左旋赖氨酸混合,能够使进入细胞内的Fe3O4纳米颗粒增多,从而加强细胞标记效果.②30 mg/L Fe3O4纳米颗粒细胞标记率可达100%,且该浓度不影响人羊膜间充质干细胞的生物活性.③30 mg/L Fe3O4纳米颗粒联合多聚左旋赖氨酸是标记人羊膜间充质干细胞的合适条件.     

不同途径羊膜间充质干细胞移植治疗大鼠脑外伤

目的:通过不同途径移植羊膜间充质干细胞治疗脑损伤大鼠,比较脑损伤大鼠行为学的改善,为脑损伤治疗选择有效的移植途径.方法:制作80只Wistar大鼠脑损伤模型,分为对照组与治疗组.对照组为单纯脑损伤大鼠,共20只;治疗组分为尾静脉移植组(A组)、侧脑室移植组(B组)、脑损伤区移植组(C组),每组20只,均给与植入人羊膜间充质干细胞,采用NSS评分法评定治疗效果.结果:脑损伤区移植组大鼠行为学改善与其他各组相比,差异有统计学意义(P<0.05);侧脑室移植组分别与尾静脉移植组及对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);而尾静脉移植组与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05).结论:脑损伤区移植羊膜间充质干细胞是治疗脑损伤大鼠的有效途径.     

不同冻存液对人羊膜间充质干细胞-80 ℃冻存与复苏效果的影响

目的:观察不同冻存液对人羊膜间充质干细胞冻存复苏后的存活率及再培养情况的影响,并探索简单有效的冻存与复苏方法.方法:将含有血清培养基短期体外培养的人羊膜间充质干细胞分为4组,分别加入不同冻存液(体积分数):A组10%二甲基亚砜 40%胎牛血清 50%DMEM/F12,B组10%二甲基亚砜 90%胎牛血清,C组5%二甲基亚砜 4.5%羟乙基淀粉 20%胎牛血清 70.5%DMEM/F12,D组10%胎牛血清 90%DMEM/F12.以相同方法冻存并复苏细胞,比较4组细胞回收率及再培养情况.结果:A、C 2组细胞复苏后回收率高于另外2组(P均<0.05),且于复苏后再培养24 h内出现较多贴壁细胞.结论:以5%二甲基亚砜 4.5%羟乙基淀粉 20%胎牛血清 70.5%DMEM/F12作冻存液冻存羊膜间充质干细胞效果好.     

量子点标记神经生长因子纳米化颗粒修饰羊膜间充质干细胞移植治疗大鼠实验性脑损伤

目的:量子点是由Ⅱ-Ⅵ族元素或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的纳米颗粒,因三维上受到量子限制而表现出独特的光学特征,其标记的神经生长因子纳米化颗粒由于是纳米级,易通过细胞生物膜.实验观察负载此纳米颗粒的羊膜间充质干细胞移植治疗大鼠脑损伤的效果.方法:实验于2007-01/10在郑州大学完成.①材料:SPF级健康成年Wistar大鼠40只,按体质量编号分为4组:神经生长因子细胞组、常规细胞组、损伤模型组、培养基对照组,10只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.羊膜间充质干细胞来自健康产妇胎盘羊膜,产妇对实验知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准.量子点神经生长因子纳米粒由兰州大学功能有机分子化学国家重点实验室协助构建.②实验方法;向羊膜间充质干细胞中加入含10%胎牛血清、20 μg/L碱性成纤维生长因子的DMEM/F12培养基,置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,待细胞达80%～90%融合时胰酶消化传代.取传至第3代细胞,分别加入终浓度为20,40,60 μg/L的量子点标记神经生长因子纳米粒进行修饰处理72 h,并设立空白对照和空载量子点对照.4组大鼠均采用Feeney自由落体法建立脑损伤模型,神经生长因子细胞组于大鼠损伤部位注入经40 mg/L量子点标记神经生长因子纳米粒修饰的羊膜间充质干细胞悬液10 μL(约4.0×108 个细胞),常规细胞组注入等量单纯量子点标记的羊膜间充质干细胞悬液,培养基对照组注入等量DMEM/F12细胞培养基,损伤模型组不给予移植操作.③实验评估:经量子点标记的神经生长因子纳米粒修饰后,MTT法检测细胞活性,荧光显微镜观察量子点在细胞内的分布,免疫细胞化学鉴定细胞分化.细胞移植后对各组大鼠运动及感觉功能进行评分,免疫组织化学染色及荧光显微镜观察量子点荧光化羊膜间充质干细胞在脑内存活分化和迁移情况.结果:①细胞生长率:培养72 h后与空白对照和空载量子点对照细胞比较,20,40,60 μg/L量子点标记的神经生长因子纳米粒组细胞生长率均呈增长趋势,40 μg/L时细胞无明显生长抑制,达60 μg/L时增长有所减慢.②体外量子点分布:荧光显微镜连续观察羊膜间充质干细胞.约6 h后开始摄入量子点标记的神经生长因子纳米粒,随着时间延长摄入量逐渐增加,于32 h荧光强度达高峰.③体外免疫细胞化学鉴定:经量子点神经生长因子纳米粒修饰的羊膜间充质干细胞表达神经元烯醇化酶和神经丝蛋白,向神经元方向分化,但不表达胶质纤维酸性蛋白.④神经行为学检测结果:细胞移植后24h,各组神经行为学各项指标评分均基本相似(P＞0.05);移植后10,20 d,损伤模型组与培养基对照组无明显变化,神经生长因子细胞组、常规细胞组运动及感觉功能各项评分均显著降低(P＜0.05),且神经生长因子细胞组下降幅度明显强于常规细胞组(P＜0.05).⑤免疫组织化学和荧光检测结果:经量子点神经生长因子纳米粒修饰的羊膜间充质干细胞在脑组织损伤区存活,并向周围迁移.结论:量子点是一种较好的细胞示踪剂,负载其标记的神经生长因子纳米化颗粒的羊膜间充质干细胞移植能够改善脑损伤大鼠神经功能.     

Fe3O4纳米化颗粒标记人羊膜间充质干细胞的合适条件

目的：Fe3O4纳米化颗粒是近来发现的活体示踪剂，由于其毒性可导致标记细胞死亡，寻找合适的浓度进行细胞标记已成为活体示踪的关键。实验以人羊膜间充质干细胞作为靶点，探讨Fe3O4纳米化颗粒标记的合适条件。方法；实验于2007—08在郑州大学完成。①细胞来源及颗粒：人羊膜间充质干细胞由郑州大学第一临床医学院神经外科杨波教授自健康产妇胎盘羊膜中提取，产妇对实验知情同意，实验经医院医学伦理委员会批准。Fe3O4纳米颗粒由美国Sigma公司生产，商品名：菲立磁，批号094k0788。转染剂多聚左旋赖氨酸购自大连宝生生物公司，批号033K4351。②实验方法：向人羊膜间充质干细胞加入含10％胎牛血清、20μg／L碱性成纤维生长因子的DMEM／F12培养基，置于37℃、体积分数为0．05的CO2饱和湿度培养箱中培养，待细胞达80％～90％融合时胰酶消化传代。取传至第3代的细胞，放入含DMEM/F12培养基的10mL培养瓶中，密度调整为1×10^9L^-1。设立3组：单纯Fe3O4组分为4个亚组，即向培养基中分别加入终浓度为20，30，40，80mg／L的Fe3O4纳米颗粒；Fe3O4＋多聚左旋赖氨酸组分为4个亚组，即向培养基中分别加入上述终浓度Fe3O4纳米颗粒后，再加入1．5mg／L多聚左旋赖氨酸；培养基对照组，仅加入DMEM／F12培养基。各组细胞标记12h后，均更换为DMEM／F12培养基培养3周。③实验评估：分别于标记后12h、36h、1周和3周，普鲁士蓝染色检测Fe3O4纳米颗粒进入细胞情况，锥虫蓝染色检测细胞活性。结果：①Fe3O4纳米颗粒标记人羊膜间充质干细胞的效果：终浓度为20mg／L的Fe3O4纳米颗粒细胞标记率为60％，终浓度为30，40，80mg／L的Fe3O4纳米颗粒细胞标记率均为100％。单纯Fe3O4组可见少量蓝染的Fe3O4纳米化颗粒分散于细胞浆内，Fe3O4＋多聚左旋赖氨酸组蓝染颗粒明显增多，部分聚     

PTTG、MMP-2在人脑星形细胞瘤中的表达及意义

目的探讨PTTG、MMP-2在人脑星形细胞瘤中的表达,研究其与病理分级的关系,分析二者在表达过程中的相互关系。方法采用免疫组织化学S-P法检测PTTG、MMP-2在正常脑组织及在不同病理级别人脑星形细胞瘤中的表达。结果 PTTG、MMP-2在2组阳性表达比较差异有统计学意义(P<0.05),表达阳性率随病理级别的增高呈增高趋势,低度恶性组与恶性组比较差异有统计学意义(P<0.05),而恶性组与高度恶性组比较差异无统计学意义(P>0.05),二者在表达过程中存在正相关(r=0.504,P<0.05)。结论 PTTG和MMP-2在人脑星形细胞瘤的发生发展过程中存在正相关性,PTTG可能通过MMP-2促进肿瘤的发生和发展。     

神经电生理监测在三叉神经痛微血管减压术中的价值

目的评价三叉神经痛微血管减压术中应用神经电生理监测的价值。方法回顾性分析2013-09—2017-03郑州大学第二附属医院院神经外科152例行微血管减压术治疗的原发性三叉神经痛患者的临床资料,以术中使用TSEP、BAEP监测的110例患者为观察组,未使用神经电生理监测的42例患者为对照组,对比分析2组有效率(含显效、好转)以及面瘫、眩晕、面部麻木及听力下降等并发症的发生情况。结果观察组术后有效率94.5%(104例),出现眩晕3例(3%);对照组术后有效率76.2%(32例),出现眩晕10例(23.8%),听力下降2例(4.8%),面部麻木5例(11.9%),面瘫1例(2.4%)。2组术后疗效及并发症发生率差异均有统计学意义(P0.05)。结论术中神经电生理监测可有效对术者实时预警,避免脑神经损伤,保障微血管减压术的效果,同时减少术后并发症。     

椎管内脓肿的诊断与显微外科治疗

目的总结椎管内脓肿的诊断与显微外科治疗。方法回顾性分析11例椎管内脓肿的临床资料:根据病史、临床表现结合MRI明确诊断,采用手术及早切除病变部位椎板,清除脓液及坏死组织。结果本组随访11例,优8例(72.7%),良2例(18.2%),可1例(9.1%);优良率90.9%。结论对于椎管内脓肿,应结合病史及临床表现,早期诊断并及时手术。     

肿瘤坏死因子-α表达与脑出血患者神经细胞凋亡的相关性研究

目的探讨脑出血患者炎性因子表达与细胞凋亡的关系。方法选取脑出血患者48例,登记临床资料并检测血肿周围脑组织TNF-α的不同时间段的表达。测定TNF-α表达:(1)Western Blot法;(2)免疫组化法。测定细胞凋亡:TUNEL法。结果 TNF-α的表达高峰期为0~24h、13~48h,TUNEL法测定神经细胞凋亡高峰期为13~48h,表明脑出血后神经细胞凋亡与TNF-α的表达高峰完全一致,存在时间变化规律一致性。以凋亡细胞数为纵轴,TNF-α表达阳性细胞数为横轴制作散点图。胞质TNF-α阳性细胞数与凋亡细胞数相关系数r为0.954,呈明显正相关。结论脑出血患者血肿周围脑组织TNF-α表达水平与神经细胞凋亡数一致。