改良液氮冻伤法建立易损动脉粥样硬化斑块模型

目的建立改良液氮冻伤法制作动脉粥样硬化(AS)易损斑块(VP)模型,验证改良法是否优于传统的造模方法。方法雄性新西兰白兔24只随机分为改良方法组(A组)和传统方法组(B组)各12只。分别按照改良方法及传统方法造模,6 w末各组随机抽取4只兔子(A1组=4只,B1组=4只)检测斑块形成状况。A组6 w末、B组10 w末剩余兔子(A2组=8只,B2组=8只)以液氮激发斑块破裂。激发48 h后取出右颈总动脉行HE染色及免疫组化检测斑块内基质金属蛋白(MMP)-1水平。不同时间点分别采集空腹静脉血检测兔血脂水平总胆固醇(TC),甘油三酯(TG)及低密度脂蛋白(LDL)及血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平。结果高脂3 d后兔血脂水平已明显升高,1 w后达基础水平的4¹5倍;血脂变化曲线可见第1周血脂上升最为明显。与基线水平相比,高脂喂养1 w后两组兔血清hs-CRP即明显升高,至激发前进一步升高,激发后hs-CRP较激发前明显升高;各时间点两组间比较无显著性差异。大体观察及HE染色可见6 w末A1组兔已形成明显的AS化斑块,而B1组兔斑块较小;激发后48 h两组兔子的右颈总动脉均可见AS表面内皮损伤,部分形成血栓;两组易损斑块在组织结构上无明显差异,免疫组化染色见两组斑块处均有MMP-1蛋白的大量表达。结论改良液氮冻伤法可构建易损/破裂粥样硬化斑块,较传统方法明显缩短成模时间,节约造模成本,更快速,更高效。     

静脉注射间充质干细胞对兔颈动脉易损斑块的影响

目的探讨静脉注射骨髓间充质干细胞(MSC)对动脉粥样硬化易损斑块(VP)稳定性的影响。方法选择雄性新西兰大白兔30只,随机分为MSC组,VP组,稳定斑块(SP)组,每组10只。分别于细胞移植后3d、1周、2周采集兔血清,ELISA法检测血清高敏C反应蛋白(hs-CRP)、TNF-α、白细胞介素6(IL-6),白细胞介素10(IL-10)水平。10周末处死所有动物,取右侧颈总动脉分别行HE染色观察镜下病变,并测量纤维帽/脂核横截面厚度的比值。结果 SP组粥样硬化斑块形态结构完整,纤维帽较厚,斑块内炎性细胞较少,未见斑块破裂。VP组斑块中心可见大量脂核,表面覆盖较薄纤维帽,肩部可见残存泡沫细胞和大量炎性细胞浸润,部分斑块可见破裂和(或)血栓形成。MSC组形态介于之间。MSC组和SP组纤维帽/脂核比值明显高于VP组(P<0.01)。与VP组比较,MSC组各时间点hs-CRP、TNF-α和IL-6水平明显降低,IL-10水平明显升高(P<0.05,P<0.01);与SP组比较,MSC组和VP组各时间点hs-CRP、TNF-α、IL-6和IL-10水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论 MSC可降低斑块不稳定性,其机制可能与降低机体炎性因子水平、增加抑炎因子及减轻炎性反应有关。     

兔骨髓间充质干细胞分离培养后的活力检测

背景：目前分离纯化骨髓间充质干细胞多采用单一的方法,对扩增培养过程中细胞活力的变化没有较为系统而全面的评估。目的：探索体外分离培养和纯化兔骨髓间充质干细胞的方法,并对细胞的活力进行检测。方法：采用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,从形态学、细胞表型和成骨成脂能力方面进行鉴定;并从细胞生长曲线、贴壁率和克隆形成率3个方面评估细胞活力。结果与结论：原代细胞多呈梭形和圆形,48h后大部分细胞贴壁,8-10d细胞融合达80%-90%,传代周期为3-5d;流式检测显示CD14、CD34和CD45表达阴性,CD29、CD44和CD90表达阳性;成骨诱导茜素红染色可见明显的钙结节,成脂诱导油红O染色可见大量脂肪细胞;细胞生长曲线、贴壁率及克隆形成率的结果表明第1代和第3代细胞的活力优于第5代细胞。结果说明密度梯度离心联合贴壁筛选的方法能够有效的分离纯化骨髓间充质干细胞,并能较好的保持其生物功能,在扩增传代过程中,细胞活力会有不同程度的下降。     

骨髓间充质干细胞拮抗氧化型低密度脂蛋白

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSC)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的影响及有关机制.方法 将对数生长期的HUVEC分成三组:对照组单纯培养HUVEC;ox-LDL组的HUVEC给予100 mg/L ox-LDL培养24 h;ox-LDL+ MSC组使用细胞培养池共同培养HUVEC和MSC,并加入100mg/L ox-LDL培养24 h.采用流式细胞术检测HUVEC的凋亡情况,采用ELISA检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF)的含量,并通过Real-timePCR检测HUVEC中凋亡相关基因Bcl-2与Bax mRNA的表达情况.结果 在100 mg/L ox-LDL作用24 h后,细胞凋亡率明显上升,细胞培养上清液中TNF-α、VEGF含量明显上升,Bcl-2 mRNA表达下调,而Bax mRNA表达上调.MSC与HUVEC共培养可增加上清液中VEGF含量,减少TNF-α含量,上调Bcl-2 mRNA表达,下调Bax mRNA表达,使内皮细胞凋亡率明显下降.结论 MSC可以拮抗ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡,可能与其分泌VEGF、抑制炎性反应并上调Bcl-2 mRNA表达及下调BaxmRNA表达有关,为MSC治疗动脉粥样硬化等内皮损伤性疾病进一步提供了理论基础.     

CFSE标记对兔骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的 探讨荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记兔骨髓间充质干细胞(Rb-MSCs)的条件及其对Rb-MSCs生物学特性的影响.方法 用全骨髓贴壁法分离纯化Rb-MSCs并进行鉴定;CFSE在不同条件下标记Rb-MSCs,流式细胞仪检测标记率及荧光强度;CCK-8法检测标记细胞的增殖能力,成骨成脂诱导检测标记细胞的分化能力,ELISA法检测标记细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)的能力.结果 原代Rb-MSCs呈梭形,集落样生长;传代后细胞变为形态均一,排列有序的成纤维细胞样,流式细胞仪检测其表面标志物符合MSCs表型.与其它标记条件相比,10 μmol/L终浓度CFSE标记Rb-MSCs 10 min,标记率达100％,且荧光强度高.标记细胞的增殖能力及分泌VEGF的能力与未标记细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05);且标记细胞具有成骨及成脂的分化能力.结论 CFSE标记Rb-MSCs是一种简单且高效的方法,适用于短期标记.且标记后Rb-MSCs的增殖能力、分化能力及分泌能力不受影响.     

兔骨髓间充质干细胞分离培养后的活力检测

背景:目前分离纯化骨髓间充质干细胞多采用单一的方法,对扩增培养过程中细胞活力的变化没有较为系统而全面的评估。目的:探索体外分离培养和纯化兔骨髓间充质干细胞的方法,并对细胞的活力进行检测。方法:采用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,从形态学、细胞表型和成骨成脂能力方面进行鉴定;并从细胞生长曲线、贴壁率和克隆形成率3个方面评估细胞活力。结果与结论:原代细胞多呈梭形和圆形,48h后大部分细胞贴壁,8-10d细胞融合达80%-90%,传代周期为3-5d;流式检测显示CD14、CD34和CD45表达阴性,CD29、CD44和CD90表达阳性;成骨诱导茜素红染色可见明显的钙结节,成脂诱导油红O染色可见大量脂肪细胞;细胞生长曲线、贴壁率及克隆形成率的结果表明第1代和第3代细胞的活力优于第5代细胞。结果说明密度梯度离心联合贴壁筛选的方法能够有效的分离纯化骨髓间充质干细胞,并能较好的保持其生物功能,在扩增传代过程中,细胞活力会有不同程度的下降。     

静脉输注间充质干细胞可稳定动脉粥样硬化易损斑块

目的建立动脉粥样硬化易损斑块(VP)模型,并静脉输注骨髓间充质干细胞(MSCs),验证MSCs对VP稳定性的影响。方法雄性新西兰兔24只,随机分为3组,VP组(n=8)制作VP模型;VP+MSCs组(n=8)制作VP模型后即刻静脉输注1×107 MSCs;SP组(n=8)制作稳定斑块模型。12周末处死所有动物,取右侧颈总动脉行H-E染色和Masson染色,并测量纤维帽厚度和脂核横截面厚度的比值。行免疫组化染色检测斑块内基质金属蛋白酶2(MMP-2)的含量。结果 H-E染色结果:VP组斑块中心可见大量脂核,斑块表面覆盖较薄纤维帽,在斑块肩部可见残存泡沫细胞和大量炎细胞浸润,部分斑块可见破裂及(或)血栓形成;SP组镜下可见粥样硬化斑块形态结构完整,纤维帽较厚,斑块内炎细胞较少,未见斑块破裂;VP+MSCs组形态介于两者之间。帽/核比值SP组>VP+MSCs组>VP组,VP组与VP+MSCs组和SP组比较差异有统计学意义(P<0.01)。Masson染色结果:SP组平滑肌细胞和弹力纤维含量高于其他两组,VP+MSCs组次之,VP组最少。斑块内MMP-2表达水平:VP组斑块内MMP-2大量表达,主要位于纤维帽和脂质核心;与VP组相比,VP+MSCs组和SP组MMP-2的表达减少,差异有统计学意义(P<0.01);VP+MSCs组MMP-2表达高于SP组(P<0.01)。结论 MSCs静脉输注干预兔VP模型,可降低斑块不稳定性,其机制可能与减少炎性细胞聚集、降低MMP-2含量、减少胶原纤维降解有关。