肾综合征出血热疫苗后备筛选毒株在Vero细胞上的适应传代及其抗原性研究

〔目的〕将肾综合征出血热疫苗后备毒株适应于Vero细胞 ,观察病变情况 ,并对其抗原性和繁殖特性进行研究。〔方法〕将新分离的汉坦病毒ZJ2、ZJ4、ZJ7株和汉城病毒ZJ5株在Vero细胞上进行连续传代 ,采用间接免疫荧光法(IFA)、反向被动血凝试验 (RPHA) ,研究传代后毒株的病毒滴度、抗原量以及细胞的病变情况 ,同时将传代后的病毒接种敏感动物 ,观察动物的发病情况和毒株的繁殖特性。〔结果〕经过 5次连续传代 ,四株病毒在Vero细胞上均显示出良好的适应性 ,从第二代开始病毒滴度稳定在 6.0 0LgTCID5 0 ml以上 ,第五代时最高达 7.5 0LgTCID5 0 ml ,第三代毒株抗原量均已达到 1:12 8,ZJ7株抗原量最高时达 1:768,四株毒株感染Vero细胞 ,连续观察 12d不见细胞产生病变 ,第五代细胞病毒液接种敏感动物 ,9d后动物发病甚至死亡。〔结论〕四株病毒已适应于Vero细胞 ,且具有病毒滴度高、毒力强和抗原性良好的特性 ,是Vero细胞肾综合征出血热灭活疫苗良好的后备筛选毒株。     

2006－2017年浙江省流行性脑脊髓膜炎流行病学特征及菌群变迁趋势分析

目的 分析浙江省流行性脑脊髓膜炎（流脑）流行病学特征及脑膜炎奈瑟菌菌群分布及变迁趋势,为流脑防控提供依据。 方法 利用2006 — 2017年全国法定传染病报告系统资料、流脑监测报告信息管理系统数据和2010 — 2016年浙江省流脑监测获取的健康人群带菌率资料,采用Excel 2010软件处理数据,运用描述流行病学方法进行统—计分析。采用SAS 9.2软件进行Cochran-Armitage趋势检验分析。 结果 2006 — 2017年浙江省累计报告流脑病例212例,死亡28例,病死率为13.21%,年均发病率为0.034 8/10万,年均死亡率为0.004 6/10万。发病率和死亡率均随着年份的增长而下降（ Z＝–13.420、–6.090,均P＜0.001）。流脑冬春季高发,占全年病例总数的91.98%。发病数累计前3位的年龄组分别为0 ~ 4岁（32.08%）、10 ~ 14岁（16.04%）和15 ~ 19岁组（13.21%）。≥15岁年龄组的流脑病例所占比例从2006 — 2011年间的42.13%上升至2012 — 2017年间的50%。2006 — 2017年浙江省共分离到病例菌株71株,包括A群、B群、C群、X群和W135群,分别有31、12、22、1和5株。2010年以来未再检出A群流脑菌,C群流脑病例构成比在20%左右上下浮动,而B群和W135群呈逐年上升趋势。A群、B群、C群和W135群均对青霉素、头孢类药物、氧氟沙星和环丙沙星敏感。 结论 浙江省流脑疫情维持在较低水平,优势流行菌群由以A群、B群、C群为主向B群、C群和W135群转变,流脑防控呈现新局面。      

II型登革病毒NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1。rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAG和Western blot检测NS1重组蛋白。结果成功克隆II型登革病毒NS1基因,SDS-PAGE、间接免疫荧光和Western blot检测表明NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与登革患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性。结论II型登革病毒非结构蛋白NS1在昆虫中表达,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定基础。     

Ⅱ型猪链球菌浙江分离株cps2J、ef、mrp基因的克隆及序列分析

目的阐明浙江省猪链球菌分离株的血清型分型,分析其与国内外其他猪链球菌Ⅱ型（SS2）菌株 cps2J、ef、mrp毒力基因的差异。方法参照GenBank上已发表的cps2J、ef、mrp毒力基因序列,设计引物 ,对6株浙江省猪链球菌分离株进行cps2J、ef、mrp全基因克隆及序列测定,并与国内外其他分离株的基 因序列进行比较。结果cps2J、ef、mrp基因的完整开放阅读框（ORF）分别为999bp、2532bp、3771bp,各 自编码333、843、1256个氨基酸。经对cps2J、ef、mrp毒力基因的序列比较与系统进化分析,6株浙江分 离株均分布在SS2发生群中,与国内外其他SS2菌株cps2J、ef、mrp基因核苷酸的同源性均较高,分别为 98.39%～100.0%、99.6%～100.0%和99.4%～100.0%,分离的年代和地区对基因的同源性和系统进化分支影 响不大。结论6株浙江省猪链球菌分离株为2型菌株,cps2J、ef、mrp基因序列非常保守,与GenBank上国 内及欧洲SS2菌株中相应序列有很高的同源性,可能有着相同的起源。     

汉坦病毒N蛋白的重组表达及其用于IgM直接捕捉ELISA的建立和应用

目的克隆并表达汉坦病毒（HV）Z10株（HV—Z10）N蛋白（NP）编码基因，建立基于辣根过氧化酶（HRP）标记重组NP（rNP）的rNP—IgM直接捕捉ELISA，检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清并评价其检测效果。方法PCR扩增HV—Z10株NP编码基因，基因工程方法构建NP编码基因原核表达系统pET28a—Z10N—E．coli BL21DE3。SDS-PAGE了解rNP表达情况，离子交换法和Ni—NTA亲和层析法提纯rNP。Western blot检测rNP的特异性免疫反应性。建立HRP标记rNP—IgM直接捕捉ELISA检测HFRS患者血清样品，并与常规HV—IgM间接捕捉ELISA进行比较。结果pET28a—Z10N—E．coli BL21DE3高效表达rNP。提纯rNPSDS-PAGE显示单一蛋白条带，HV-IgG能有效识别rNP并与之结合。94．73％（90／95）HFRS患者血清样品rNP—IgM直接捕捉ELISA检测结果阳性，HV—IgM间接捕捉ELISA阳性率为92．63％（88／95）。两种IgM捕捉ELISAs检测的HFRS患者血清样品A450值分布及对多份不同稀释度血清检测的A450，均值变化均相似。结论成功构建了HV—Z10株NP编码基因高效原核表达系统。所建立的rNP—IgM直接捕捉ELISA可作为HFRS简便、安全、敏感、特异的血清学诊断新方法。     

肾综合征出血热病毒高效价免疫血清抗体毒株的筛选

肾综合征出血热（HFRS）是由布尼亚病毒科汉坦病毒属引起的急性传染病。在HFRS病毒和疫苗的研究工作中，常采用间接免疫荧光抗体（IFA）技术和直接荧光抗体（FA）技术。利用高效价兔抗HFRS病毒免疫血清制备的荧光血清在检测HFRS病毒抗原：亡作中，具有特异、快速的优点忙，而荧光血清的质量与免疫血清的效价有直接关系，不同生物学特性的HFRS毒株免疫敏感动物家兔后，其免疫血清的效价有一定的差异。因此，能产生高效价免疫血清的毒株筛选是制备高质量荧光血清的关键。     

肾综合征出血热灭活疫苗免疫大鼠的抗体应答

本文对实验大鼠进行单价肾综合征出血热灭活疫苗免疫，结果表明免疫大鼠能产生较高的同型和异型中和抗体及IFA抗体应答，因而，大鼠可以作为疫苗效力评价的实验动物。     

浙江新分离汉坦病毒ZT71株S基因片段的克隆及序列分析

目的为了获得浙江省汉坦病毒基因组更为详尽的资料,研究汉坦病毒的进化状况及变异程度,为疫苗病毒株的选择使用提供科学依据。方法本实验室利用RT-PCR方法扩增ZT71株S基因片段并克隆入质粒载体,进行核苷酸序列测定及分析。结果ZT71株S基因由1754个核苷酸组成,只有一个开放读码框架,共编码429个氨基酸。与HTN型病毒(76-118)的核苷酸和氨基酸同源性分别为72.0%和82.6%,与SEO型病毒(SR-11、R22、Guo3、8610)核苷酸和氨基酸同源性分别为88.4%—96.5%和98.1%—99.0%,与其它型汉坦病毒的同源都很低。结论表明此分离的病毒为SEO型汉坦病毒,为进一步研究其进化和变异提供了有利条件。     

浙江省2000年肾综合征出血热监测分析

为探索肾综合征出血热 (HFRS)流行特征 ,以制定有针对性的防治措施。采用间接免疫荧光法 (I FAT)检测EHF病人血清中抗体 ,采用直接免疫荧光法 (FAT)检测鼠肺汉坦病毒 (HV)抗原。结果表明 ,全省 15 0 7例病人 ,主要分布在浙东和浙西丘陵区、浙南山区 ,5、6月及 12月和翌年 1月为二个发病高峰 ,青壮年农民发病最多。今后应对以姬鼠型为主的混合型疫区选择双价疫苗进行预防接种 ,以降低发病率。     

浙江省1997至2000年肾综合征出血热监测分析

目的：通过对肾综合征出血热（HFRS）监测分析,掌握全省HFRS的流行规律,控制其暴发流行,进一步降低该病的发病率,为制定防制措施提供依据。方法：采用直接免疫荧光（FAT）法,检测鼠肺HV抗原,采用间接免疫荧光（IFAT）法检测HFRS病人,健康人血清及鼠血中HV抗体,结果：1997－2000年全省共发病9041例,年均发病率为5．08／10万,死亡48人,病死率为0．53％,病例仍主要分布在沿钱塘江两岸的浙东和浙西丘陵区,浙南山区次之,浙北平原区和海岛区病例较少,全省11个地市均有发病,以浙东和浙西丘陵区的绍兴,宁波,台洲,衢州,杭州和金华6市发病最多。宿主动物野外以黑线姬鼠为优势种,占80．79％,室内以褐家鼠为优势种,占80．91％,结论：需要进一步加大监测力度,同时接种HFRS疫苗。