四种病毒灭活方法用于登革病毒灭活效果的比较

目的评价常用病毒灭活方法对血液制品中登革病毒(DENV)的灭活效果。方法将单采新鲜冰冻血浆(FFP),人凝血因子Ⅷ(FⅧ)和静脉注射免疫球蛋白(IVIG)3种血浆及其制品中加入高滴度(8.00-9.25)的登革病毒液,分别采用亚甲蓝(MB)光化学法灭活FFP、有机溶剂/去污剂(S/D)法灭活FⅧ、低pH常温孵化法和巴氏消毒法灭活IVIG;以1×10~6/mL A549细胞接种于T25的培养瓶中作为病毒传代及滴度滴定指示细胞,将灭活前后的血浆及制品接种于A549细胞并检测其DENV滴度,并通过qRT-PCR对DENV RNA做定量检测;评估不同的灭活方法对DENV的灭活效果。结果 DENV滴度下降:MB光化学法灭活FFP下降滴度≥5.92 log,S/D法灭活FⅧ下降滴度≥5.17 log、巴氏法和低pH法灭活IVIG均下降滴度≥5.92 log,其中MB光化学法灭活FFP、SD灭活FⅧ及巴氏法灭活IVIG后DENV RNA(cp/mL)降低1.25 log-2.25 log,低pH法灭活IVIG后DENV RNA(cp/mL)降低0.17 log。所有血浆和血液制品样品经灭活后,在DENV宿主细胞上3代盲传后均未检测到DENV RNA。结论 4种常用病毒灭活方法均能有效灭活血浆及血液制品中的DENV。     

泛素特异性蛋白酶18刺激乙型肝炎病毒复制的初步研究

目的了解泛素特异性蛋白酶18(USP18)对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响及其潜在机制。方法 1)USP18和Pol质粒构建:采用常规基因克隆方法,将人USP18编码序列及HBV多聚酶(Pol)编码序列分别构建到pcDNA3.1-3tag真核细胞表达载体内。2)研究Pol对USP18的影响:高表达转染Pol质粒至Hep AD38细胞内,抽提细胞内总RNA,逆转录成c DNA,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Pol对USP18的影响。3)研究USP18对HBV的影响:高表达转染USP18质粒至Hep AD38细胞内,抽提细胞内总RNA和总DNA,qRT-PCR检测USP18对HBV复制的影响。4)研究Pol与USP18之间的相互作用:将Pol质粒按一定比例转染到铺有293T细胞的10cm培养皿中,采用免疫共沉淀的方法检测Pol与USP18之间是否存在相互作用。结果成功构建USP18和Pol表达质粒,并在HepAD38细胞中高表达;过表达Pol蛋白促进USP18表达;过表达USP18刺激HBV复制;Pol与USP18存在相互作用。结论初步证明USP18可能通过与Pol相互作用促进HBV复制。     

环状RNA hsacirc0000290调控寨卡病毒复制的分子机制的初步探究

目的 探究可经血液传播的寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)在体外感染细胞后对环状RNA hsa＿circ＿0000290表达的影响及hsa＿circ＿0000290对寨卡病毒复制的影响。方法 ZIKV感染A549或U251细胞后,连续1～4 d收集细胞并提取细胞总RNA。通过RT-qPCR检测hsa＿circ＿0000290的表达变化;hsa＿circ＿0000290由PDHX转录产生。通过转染siRNA敲低hsa＿circ＿0000290的表达后,通过RT-qPCR和Western blot检测对ZIKV和PDHX表达的影响。通过核质定位实验验证hsa＿circ＿0000290在细胞中的定位。结果 与对照组相比,hsa＿circ＿0000290在感染ZIKV 1～4 d的A549和U251细胞中表达上调;hsa＿circ＿0000290主要定位于细胞核,敲低细胞内hsa＿circ＿0000290的表达水平可以抑制ZIKV RNA复制和ZIKV NS1蛋白的表达,促进PDHX的表达。结论 ZIKV感染细胞后,hsa＿circ＿0000290表达水平显著升高;hsa＿circ＿...     

雷公藤对固有免疫分子干扰素诱导的研究

目的:为了探索具有免疫抑制和抗炎作用的雷公藤对干扰素的影响,以及雷公藤的风湿免疫性疾病治疗效果与干扰素的关系。方法:以1 ug/m L、5 ug/m L、10 ug/m L 3个浓度梯度的雷公藤作用于Huh7.5.1细胞48 h,采用荧光定量聚合酶链反应法定量检测甲氨蝶呤干预后Huh7.5.1细胞内IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、Mx A的mRNA表达量。结果:雷公藤能够诱导细胞产生内源性IFN-α、IFN-β、IFN-γ,使干扰素信号通路下游因子ISG15和Mx A高表达。结论:雷公藤治疗风湿免疫性疾病的良好疗效与干扰素相关,为进一步研究雷公藤的作用机制和开发利用提供理论依据。     

甲氨蝶呤对固有免疫关键分子干扰素的影响研究

目的 为了探究具有免疫抑制和抗肿瘤作用的甲氨蝶呤(MTX)对干扰素(IFN)的影响,以及IFN在风湿免疫性疾病中的作用.方法 以5、20、100 μg/mL浓度梯度的MTX作用于Huh7.5.1细胞48 h,采用实时荧光定量PCR法定量检测MTX干预后Huh7.5.1细胞内IFN-α、IFN-β、IFN-γ、干扰素刺激基因15(ISG15)、抗黏病毒蛋白(MxA)的mRNA表达量.结果 Huh7.5.1细胞在MTX(5、20 μg/mL)干预下内源性IFN-α、IFN-β的mRNA表达量与对照组相比均明显上升,差异均有统计学意义(P＜0.05),并且随着MTX干预浓度的上升而上升;MTX浓度为100μg/mL时,与对照组相比虽有上升但差异无统计学意义(P＞0.05).而IFN-γ的mRNA表达量仅在MTX浓度为20μg/mL时与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),在5、100μg/mL时虽有上升但差异无统计学意义(P＞0.05).在MTX干预后,MxA和ISG15的mRNA表达量均有不同程度的上升(P＜0.05).结论 小剂量MTX治疗风湿免疫性疾病取得良好的疗效与IFN相关.