结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的 克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达.方法 采用热启动聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白.结果 经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0.6,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22.8%.结论 构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础.     

针对S基因的siRNA或shRNA表达框对HepG2.2.15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用比较

目的 化学合成针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的siRNA，同时制备针对相同区段的shRNA表达框，并比较二者对HepG2．2．15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用。方法 化学合成针对HBVS基因的带有FITC标记的siRNA，设计合成带有FTrc标记的引物，PCR扩增含有RNA聚合酶Ⅲ启动子H1序列和shRNA编码序列的表达框，并对扩增产物进行纯化，将等摩尔数siRNA和shRNA表达框分别用脂质体转染稳定表达HBV的HepG2．2．15细胞，转染1d后流式细胞仪检测转染效率，转染3d后RT-PCR检测靶基因mRNA的水平，用SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测HBsAg的表达。收集转染前和转染后1、3、5和7d的细胞培养上清，检测HBsAg水平，同时用荧光定量PCR方法检测HBV　DNA的含量。结果成功制备了针对HBVS基因的shRNA表达框，将其与等摩尔数siRNA分别转染HepG2．2．15细胞后，RT-PCR证实细胞中HBV　mRNA水平降低，SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测到HBsAg的表达受到抑制，细胞培养上清中HBsAg和HBV DNA含量下降。与siRNA相比，shRNA表达框对HBV的抑制作用虽然起效较慢，但持续时间更长。结论shRNA表达框和siRNA均可明显抑制HBV的转录和表达，与siRNA相比，shRNA表达框能够更持久地抑制靶基因的表达。     

TTV核酸模板快速制备方法

目的 寻求建立适合大批量临床标本检测TT病毒（TTV）核酸快速制备方法,直接用于PCR扩增。方法 应用蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法与直接快速裂解法,分别制备TTV核酸做PCR模板,用于TTV的聚合酶链反应的快速检测。结果 在30例非甲－非庚型肝炎血清和50例慢性乙型肝炎患血清,应用经典的蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法和直接快速裂解法,分别制备TTV核酸模板,在相同条件下进行PCR扩增,结果两种制备方法的符合率为89％。结论 TTV是一种新发现的肝炎病毒,目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为诊断依据,建立了具有快速、简便、适合大批量临床标本中TTV核酸制备方法,对TTV肝炎的快速诊断,具有重要的意义。     

血细胞检测流水线系统对白细胞形态的影响

目的探讨XN-9000全自动血细胞检测流水线系统对白细胞形态的影响。方法采用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K 2)专用负压管对空军军医大学西京医院和西安培华学院医学院收集的238例受试者(其中淋巴细胞性白血病26例、粒细胞性白血病17例、单核细胞性白血病15例、健康儿童80例、健康成人100例)采集静脉血2 mL,采用XN-9000全自动血细胞检测流水线系统在1 h内完成推片、瑞姬染色、阅片,同时采用手工推片、手工瑞姬染色,由两位经验丰富的主管技师进行显微镜分类计数。结果238例受试者EDTA-K 2抗凝血仪器推片后分别采用仪器染色和手工染色分类计数Ⅱ型反应性淋巴细胞结果[(8.65±2.35)%、(8.55±2.45)%]明显高于手工推片仪器染色和手工推片手工染色结果[(4.57±2.55)%、(4.67±2.45)%],差异有统计学意义(P<0.05)。健康对照者(健康儿童及成人)、粒细胞性白血病和单核细胞性白血病患者抗凝血经仪器推片分类计数Ⅱ型反应性淋巴细胞分别为(3.2±0.5)%、(3.5±0.4)%、(3.6±0.5)%,与手工推片结果[(3.1±0.8)%、(3.2±0.6)%和(3.4±0.8)%]比较,差异无统计学意义(P>0.05)。淋巴细胞性白血病患者淋巴细胞形态有明显改变:淋巴细胞体积增大,外形不规则,着色不均,边缘蓝色较深,细胞核不规则,染色质细致,细胞质呈淡紫红色,似Ⅱ型(不规则型/单核细胞型)反应性淋巴细胞。淋巴细胞性白血病患者Ⅱ型反应性淋巴细胞的仪器推片结果为(85.2±5.6)%,与手工推片结果[(3.5±0.9)%]比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论XN-9000全自动血细胞检测流水线系统对EDTA-K 2抗凝血活化膨胀的白细胞无法调节推片力度,加之白血病患者的血细胞密度高、阻力大而致细胞形态改变,使淋巴细胞似Ⅱ型反应性淋巴细胞,影响临床对疾病的诊断。手工推片可调节角度、速度及力度,细胞形态不易改变。当Ⅱ型反应性淋巴细胞多时,必须手工推片手工染色,显微镜检查确证后方可发报告。     

G6PC基因复合杂合突变致糖原累积病Ⅰa型1例

糖原累积病(GSD)是糖原和脂质在肝、肾内异常累积导致的以肝脏和肾脏肿大为特点的一种常染色体隐性遗传病,其中Ⅰ型 GSD 最为多见,发病率为1/20 万～1/10 万.Ⅰ型 GSD又称 von Gierke病,主要包括Ⅰa 和Ⅰb 两种亚型,Ⅰa 型为葡萄糖-6-磷酸酶缺乏症,Ⅰb 型为葡萄糖-6-磷酸转移酶缺陷[1].患儿常因罹患与年龄不符的疾病而就诊,如高尿酸血症所致痛风、高脂血症所致急性胰腺炎,甚至以低血糖昏迷、乳酸酸中毒等急性并发症就诊,但由于Ⅰ型GSD发病率低,首发症状非特异,确诊方法复杂,故易造成误诊、漏诊[2-5].随着基因测序技术在临床逐步开展,GSD的确诊方法由过去有创的肝脏组织活检更新为无创的基因检测,有效提高了该病的诊断率[6].现报道笔者临床检验工作中发现的 GSDⅠa 型合并先天性心脏病 1 例.     

采用稀释法评价狼疮抗凝物对凝血因子活性检测的干扰

目的 探讨稀释法在评价狼疮抗凝物(LAC)对凝血因子活性检测的干扰中的应用.方法 选取该院健康体检者30例作为作为对照组,将这30例受试者的混合血浆标本分别按1:1、1:21、1:22、1:23、1:24、1:256种不同稀释比例配制成不同浓度的血浆,检测标本中的凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ、FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅩ活性,将其与所对应稀释度的理论值作线性相关分析.选取于该院住院治疗的LAC阳性且凝血酶原时间(PT)、活化的部分凝血活酶时间(APTT)均延长的抗磷脂综合征患者6例作为LAC阳性组.将6例LAC阳性组患者的血浆标本按同样的方法进行梯度稀释并对上述8种凝血因子的活性进行检测.结果 对照组8种凝血因子活性检测值与理论值均呈直线相关(R2≥0.90,P<0.05).随着稀释倍数的增加,内源性凝血因子活性随之升高,能恢复到大致正常水平,且升高到一定水平时不再随着稀释倍数的增加而继续升高.结论 病理性抗凝物质如LAC可对内源性凝血因子活性检测造成干扰,稀释法可通过降低干扰物质的滴度来获得更加准确的凝血因子检测值.     

链霉亲和素-自噬相关基因融合蛋白的原核表达及纯化

目的 构建链霉亲和素（streptavidin,SA）和自噬相关基因（Beclin 1）重组质粒,并对融合蛋白SA-Beclin 1进行表达和纯化.方法 利用基因重组技术将核心SA与Beclin 1序列连接,克隆人pQE80形成pQE80-SA-Beclin 1重组载体,IPTG诱导融合蛋白原核表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blot鉴定.结果 PCR成功扩增核心SA活性中心,酶切鉴定和测序均证实重组载体pQE80-SA-Beclin 1构建成功;IPTG诱导后SA-Beclin 1融合蛋白（含His标签）在大肠杆菌中高效表达,SDS-PAGE分析表达的融合蛋白以包涵体为主,经镍亲和凝胶层析柱纯化得到融合蛋白,Western blot鉴定其相对分子量约为72000kD,与预期相符.结论 本文成功构建了重组质粒并表达纯化了SA-Beclin 1融合蛋白,为进一步研究SA-Beclin 1的功能及临床应用奠定了基础.     

RNA干扰技术及其在前列腺癌基因治疗研究中的应用

RNA干扰(RNA i)是指生物体内由双链RNA(dsRNA)介导同源序列mRNA的特异性降解,从而导致基因沉默的现象。近年来,随着对RNA i研究的不断深入,其作用机制正逐步阐明;同时作为阻断基因表达的新手段,RNA i技术也日趋完善和成熟。它具有高效性和特异性,为RNA i在肿瘤的基因治疗方面的应用提供了有力的工具。本文综述RNA i技术的有关研究进展及其在前列腺癌基因治疗研究中的应用。     

水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达

目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法: 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2, pPIC9K-HV2-N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果: 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性. 结论: 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础.     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达。方法采用热启动聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白。结果经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0．6,IPTG终浓度为0．3 mmol／L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22．8％。结论构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础。