幽门螺杆菌感染与血液病

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是1983年澳大利亚学者Warren和Marshall首次从胃黏膜组织中分离出的一种螺旋样细菌,自此揭开了人类研究Hp与胃肠疾病关系的序幕,彻底改变了很多胃肠道疾病的理论.     

CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞的诱导培养及鉴定

背景:新近发现CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞在参与免疫负向调控机制和临床治疗上有潜在的意义。目前对于健康人骨髓来源的调节性树突状细胞的体外诱导培养及鉴定的研究较少。目的:体外培养正常人骨髓来源的具有CD11clowCD45RBhigh表型的调节性树突状细胞,从细胞形态、免疫表型、吞噬功能及刺激T淋巴细胞增殖能力等方面对其进行鉴定。方法:分离正常人骨髓单个核细胞分别在不同的培养体系中进行体外诱导培养,实验分3组:①调节性树突状细胞组,在含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素10,转化生长因子β1的1640培养基中培养7d后,用脂多糖刺激24h。②未成熟树突状细胞组,用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4的1640培养基培养8d。③成熟树突状细胞组,用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4的1640培养基培养7d后,予脂多糖刺激24h,使其成熟。光镜和扫描电镜观察树突状细胞的形态,流式细胞仪检测其免疫表型以及吞噬能力,CCK-8法检测其刺激异基因淋巴细胞增殖能力。结果与结论:①人骨髓源单个核细胞在联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素10,转化生长因子β1培养8d后获得的细胞具有调节性树突状细胞的典型特征和免疫表型,说明该实验建立的培养调节性树突状细胞的方法是切实可行的。②CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞这种新亚群具有较强的吞噬能力,刺激T淋巴细胞增殖的能力较弱,为调节性树突状细胞诱导免疫耐受的进一步研究奠定实验基础。     

甲氧基聚乙二醇衍生物与抗OX40L单抗双诱导移植物免疫耐受

背景:甲氧基聚乙二醇可在淋巴细胞表面形成空间位阻而遮蔽T细胞表面抗原:OX40及其配体OX40L是一对重要的协同刺激信号分子,阻断该信号通路可使T细胞处于无反应性的失能状态,诱导免疫耐受.目的:为获得更为理想的免疫耐受状态,检测甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酸酯(methoxy-polyethyleneglycol-succinimidyl-propionic acid ester,mPEG-SPA)化学修饰联合抗OX40L单抗对移植物T淋巴细胞增殖、表型及分泌细胞因子的影响.设计、时间及地点:对比观察移植物免疫耐受体外实验,于2006-12/2007-06在徐州医学院附属医院血液病研究室完成.材料:清洁级近交系C57BL/6(H-2b)雄性和BALB/c(H-2d)雌性成年小鼠各12只,制备的脾淋巴细胞分别作为反应细胞和刺激细胞.mPEG-SPA为北京凯正公司产品,大鼠抗小鼠OX40L单抗为eBioscicnce公司产品.方法:将反应细胞密度调整为4×109 L-1,分别加入3,6,12,15,18 g/L mPEG-SPA修饰1 h,以加入相同体积的磷酸盐缓冲液作空白对照;另向反应细胞中加入15g/L mPEG-SPA分别修饰1 h,24 h,48 h,96 h,120 h,流式细胞仪检测脾淋巴细胞表面CD3分子的表达.单向混合淋巴细胞培养分4组:细胞对照组,单纯加入刺激细胞 反应细胞:抗OX40L单抗组,向两种细胞中加入10 mg/L抗OX40L单抗:mPEG-SPA组,向两种细胞中加入15 g/L mPEG-SPA;联合组,向两种细胞中加入抗OX40L单抗和mPEG-SPA.主要观察指标:CD3分子的表达水平,其反映mPEG-SPA遮蔽脾淋巴细胞的效果.淋巴细胞增殖情况与表型分析.培养上清细胞因子含量.结果:①不同浓度mPEG-SPA修饰后淋巴细胞表面CD3分子的表达均明显低于空白对照,且15,18 g/L mPEG-SPA降低幅度尤为明显(P<0.05):15g/L mPEG-SPA修饰不同时间后CD3分子的表达无变化(F=1.715,P>0.05).与细胞对照组比较,抗OX40L单抗组、mPEG-SPA组、联合组对淋巴细胞的增殖抑制率均明显升高,联合组抑制效果最强(P<0.01);抗OX40L单抗组、mPEG-SPA组T细胞表型CD4 CD25 ,CD8 CD25 比值无明显变化(P>0.05),联合组明显降低(P<0.05).抗OX40L单抗组、mPEG-SPA组、联合组γ-干扰素含量均明显低于细胞对照组,且联合组降低幅度更为显著(P<0.05);联合组自细胞介素4含量明显高于细胞对照组(P<0.05).结论:甲氧基聚乙二醇衍生物可明显遮蔽淋巴细胞表面抗原,且对抗原的遮蔽作用较持久;其与抗OX40L单抗联合应用能够阻断T细胞激活的抗原和共刺激双信号通路,抑制T细胞的增殖活性,使Th0类细胞向Th2类细胞偏离.     

移植物化学修饰与阻断 OX40-OX40L途径预防异基因骨髓移植小鼠移植物抗宿主病的研究

目的 观察甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酸酯(mPEG-SPA)与抗OX40L单抗预处理移植物对小鼠异基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病(aGVHD)的影响及其机制.方法 供、受鼠的脾淋巴细胞体外混合培养,加入抗OX40L单抗孵育培养后,再用mPEG-SPA化学修饰,与C57BL/6供鼠骨髓细胞混合后移植给经致死量全身照射的BALB/c受鼠.同时设相应的对照组.观察移植后受鼠aGVHD的临床表现、病理学改变、存活时间及生存率等,检测移植鼠T淋巴细胞亚群,细胞因子的变化及异基因嵌合体.结果 ①单纯骨髓移植对照组小鼠均出现aGVHD临床表现,17 d内全部死于aGVHD,存活时间为(12.1±5.5)d;而mPEG-SPA和抗OX40L单抗单独或联合预处理组小鼠一般状态较好,部分出现aGVHD表现,且较单纯骨髓移植对照组症状轻,皮肤、肝脏、小肠病理表现均较单纯骨髓移植对照组明显减轻,mPEG-SPA和抗OX40L单抗单独或联合预处理组小鼠存活时间分别为(36.2±24.9)、(32.0±24.8)和(44.3±23.2)d,均较单纯骨髓移植对照组明显延长(P＜0.05),其中抗OX40L mPEG-SPA联合预处理组小鼠平均存活时间最长(P＜0.05),mPEG-SPA单独预处理组和抗OX40L单独预处理组牛存率分别为50.0%、41.7%,明显高于单纯骨髓移植组,OX40L mPEGSPA联合预处理组生存率最高,为66.7%.②移植后对照组小鼠血清IFN-γ浓度升高,在+10～+15d时达高峰;而mPEG-SPA和抗OX40L单抗单独或联合预处理组降低,+10 d时降至最低,OX40LmPEG-SPA联合预处理组降低最明显(P＜0.01).移植后对照组IL4、IL-10浓度轻度降低,而mPEG-SPA和抗OX40L单抗单独或联合预处理组均明显升高(P＜0.05),+10～+15 d达高峰,以联合组升高最明显(P＜0.01).③mPEG-SPA和抗OX40L单抗单独或联合预处理组+60 d时异基因嵌合率为95%～100%,证实为完全供者型植入.结论 mPEG-SPA与抗OX40L单抗联合应用能够阻断T细胞激活的抗原和共刺激双信号通路,协同抑制T细胞的增殖活性,促进Th0细胞向Th2细胞分化,从而明显减轻小鼠骨髓移植中aGVHD的发生.     

CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞的诱导培养及鉴定

背景：新近发现CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞在参与免疫负向调控机制和临床治疗上有潜在的意义。目前对于健康人骨髓来源的调节性树突状细胞的体外诱导培养及鉴定的研究较少。 目的：体外培养正常人骨髓来源的具有CD11clowCD45RBhigh表型的调节性树突状细胞,从细胞形态、免疫表型、吞噬功能及刺激T淋巴细胞增殖能力等方面对其进行鉴定。 方法：分离正常人骨髓单个核细胞分别在不同的培养体系中进行体外诱导培养,实验分3组：①调节性树突状细胞组,在含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素10,转化生长因子β1的1640培养基中培养7 d后,用脂多糖刺激24 h。②未成熟树突状细胞组,用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4的1640培养基培养8 d。③成熟树突状细胞组,用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4的1640培养基培养7 d后,予脂多糖刺激24 h,使其成熟。光镜和扫描电镜观察树突状细胞的形态,流式细胞仪检测其免疫表型以及吞噬能力,CCK-8法检测其刺激异基因淋巴细胞增殖能力。 结果与结论：①人骨髓源单个核细胞在联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素10,转化生长因子β1培养8 d后获得的细胞具有调节性树突状细胞的典型特征和免疫表型,说明该实验建立的培养调节性树突状细胞的方法是切实可行的。②CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞这种新亚群具有较强的吞噬能力,刺激T淋巴细胞增殖的能力较弱,为调节性树突状细胞诱导免疫耐受的进一步研究奠定实验基础。     

金黄色葡萄球菌和纤维连接蛋白结合蛋白A对血管内皮细胞紧密连接的破坏作用

目的观察金黄色葡萄球菌和纤维连接蛋白结合蛋白A基因（fnBA）敲除金黄色葡萄球菌菌株对人微血管内皮细胞（HMEC-1）紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5的影响，并探讨金黄色葡萄球菌侵袭血管内皮细胞的机制。 方法将野生金黄色葡萄球菌菌株NCTC8325与HMEC-1按100︰1比例共培养，实时定量RT-PCR检测共培养30 min、60 min和120 min时HMEC-1紧密连接成份ZO-1和Claudin-5 mRNA的表达，同时应用Western blot分析和免疫组织化学染色观察共培养不同时间紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-5的表达。构建fnBA基因敲除突变菌株NCTC8325ΔfnbA，以野生金黄色葡萄球菌菌株NCTC8325为阳性对照，观察突变株NCTC8325ΔfnbA与HMEC-1共培养120 min后紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-5的变化。 结果金黄色葡萄球菌NCTC8325与HMEC-1共培养30 min、60 min和120 min后紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5 mRNA的表达在30 min、120 min时较对照组显著下降[30 min时与对照组比较：ZO-1：t = 4.104、P = 0.015，Claudin-5 mRNA：t = 2.802、P = 0.049；120 min时与对照组比较：ZO-1：t = 3.478、P = 0.025，Claudin-5 mRNA：t = 1.802、P = 0.261]，但60 min时ZO-1、Claudin-5 mRNA的表达有一过性升高。与金黄色葡萄球菌NCTC8325共培养后，免疫组织化学结果发现在30 min时ZO-1和Claudin-5两种紧密连接蛋白较对照组表达显著下降（t = 33.6、59.03，P均< 0.001），120 min时ZO-1和Claudin-5两种紧密连接蛋白较对照组表达亦显著下降（t = 31.8、60.75，P均< 0.001）；Western blot与免疫组组织化学结果一致。与突变菌株NCTC8325ΔfnbA共培养30 min、60 min和120 min后，在30 min和60 min时ZO-1、Claudin-5蛋白的表达与NCTC8325组差异无统计学意义（P均> 0.05），在120 min时ZO-1和Claudin-5蛋白的表达较NCTC8325组显著升高，差异均有统计学意义（ZO-1：t = 14.89、P < 0.001，Claudin-5：t = 7.008、P = 0.002）。 结论金黄色葡萄球菌能通过下调紧密连接蛋白破坏HMEC-1紧密连接屏障，且其表面蛋白FnBPA发挥了重要作用。